Optimisation de la culture rénale organoïde et organotypique pour la vascularisation, le développement prolongé et l’imagerie améliorée de microscopie

La culture des organes rénaux et les organites dérivés de cellules souches programmées fournissent d’excellents moyens d’étudier les mécanismes qui sous-œuvrent le développement du rein et la maladie. Le système actuel de culture d’organe ne fournissent pas le flux sanguin au rein, cependant. Pour cette raison, la raison pour laquelle les modèles actuels sont incomplets et ne parviennent pas à récapituler la fonction principale du rein, qui est la filtration du sang.

Dans cette publication, nous présentons un protocole amélioré pour la culture et la visualisation des reins embryonnaires et organoïdes sur la membrane chorioallantoïque de l’embryon de poulet. Dans notre nouvelle mise en place expérimentale, nous superposons les rudiments rénaux transplantés sur cam avec des réservoirs perméables signifiants qui sont remplis de milieu culturel. Ce protocole augmente considérablement la survie des rudiments rénaux et aussi des cellules endothéliales intrinsèques.

La méthode permet le flux sanguin vers le glomerulus en développement. Récemment, nous avons également publié une nouvelle méthode de culture d’organes à direction fixe qui offre haute résolution confocal 3D time-lapse imagerie. La méthode a fourni des conditions optimales pour l’imagerie confocale à long terme des organoïdes et des rudiments d’organe.

Dans l’approche, nous comprimons doucement le tissu entre un glissement de couverture en verre et une membrane perméable. Ici, nous montrons comment les plaques conçues sur mesure sont faites et comment les expériences de culture sont mis en place. Ainsi, dans cette publication nous présentons une technique améliorée de culture rénale de tube d’organelle.

Cette méthode offre une meilleure façon de modéliser la genèse organelle et de mener l’imagerie à haute résolution pour étudier les reins embryonnaires et organoïdes rénaux ex vivo. Selon votre expérience, prenez des contre-inserts de cellules de transfert conçus pour des plaques de six puits ou de 12 puits. Coupez les côtés de l’insert à l’aide d’un outil Dremel pour créer un anneau en plastique de deux millimètres de haut avec une membrane perméable attachée à elle.

Polir les bords de l’anneau de swarf avec un scalpel ou un couteau pointu. Stériliser les mini réservoirs dans 70% d’éthanol pendant au moins une heure. Lavez ensuite les mini réservoirs en autoclave à l’eau distillée et séchez-les dans un capot laminaire.

Rincer les mini réservoirs dans PBS et milieu de culture. Placez le réservoir sur une boîte de Pétri sur notre milieu de culture avec la membrane orientée vers le haut. Disposer les reins embryonnaires ex vivo disséqués ou les organoïdes rénaux sur la membrane.

Évitez de laisser beaucoup de liquide autour des échantillons et laissez-les attachés de deux à 24 heures dans un incubateur de culture cellulaire. La transplantation exénale est faite à la membrane chorioallantoic du poulet embryonnaire ex ovo de huit jours. Transférer les mini réservoirs de sorte que la membrane couvre la greffe.

Placez-les à la périphérie de l’AMC afin qu’ils ne couvrent pas l’embryon. Ajoutez ensuite le milieu de culture aux mini réservoirs. Cultiver les échantillons sur le poulet CAM pendant neuf jours au maximum.

Remplacez quotidiennement le milieu de culture dans les mini réservoirs. La vascularisation des échantillons peut être observée déjà 24 à 48 heures après la transplantation. Pour faire les plaques de six puits conçues sur mesure pour la culture fixe.

Vous devez commencer par percer des trous de 20 millimètres dans le fond de la plaque à l’aide d’une machine de forage avec un foret approprié. Ensuite, polir les jantes des trous sur le côté supérieur de la plaque. Enfin, stériliser les plaques à 70% d’éthanol pendant au moins une heure.

Ensuite, lavez les assiettes en autoclave à l’eau distillée et séchez-les dans une hotte lemiar. Lavez le couvercle de 22 x 22 millimètres glissé dans 70% d’éthanol et laissez-les sécher complètement. Collez le bordereau de couverture sur le dessus d’un trou dans le fond d’un puits à l’aide de colle de tissu.

Après séchage, inspecter les plaques au microscope stérile et enlever l’excès de colle. Tout d’abord, mélanger un aliquot de perles de polystyrène avec un volume égal d’hydrogène. Placez l’insert de transfill sous un microscope disséquant avec la membrane orientée vers le haut et arrangez les reins sur la membrane.

Ajouter une goutte de mélange de perles hydro-gel à côté des reins avec soin. Retournez l’insert transfill de sorte que la membrane et les reins sont orientés vers le bas. Ensuite, placez soigneusement l’insert dans notre puits de plaque de six puits conçue sur mesure.

Poussez l’insert très doucement dans le puits. Suivez le degré d’aplatissement du microscope jusqu’à ce que le rein soit au niveau avec les perles. Gardez l’insert légèrement pressé au puits d’une main et fixez-le à la plaque en faisant fondre le plastique à trois points à la périphérie de l’insert avec un fer à soudé.

Ajouter deux millilitres de culture dans le puits à travers une ouverture sur le côté. Lorsque vous démarrez une imagerie en accéléré, transférez la plaque dans l’incubateur sur scène d’un microscope inversé. Notre protocole modifié de capture cam permet une vascularisation très efficace des organoïdes rénaux et des reins embryonnaires.

De nombreux réservoirs contenant du milieu de culture alimentent les tissus des donneurs et les protègent contre le séchage pendant la période initiale du vascularizaton. Ce film montre le flux de cellules sanguines de poulet dans un centre embryonnaire de rein de souris greffé au poulet CAM et cultivé pendant sept jours. Ce panneau de figure montre que notre méthode améliorée de culture de CAM fournit des conditions permissives pour les cellules endothéliales dérivées rénales.

Les figures A et B montrent que les reins embryonnaires cultivés pendant cinq jours sur la culture d’intervalle de jours ont été greffés au centre au poulet CAM pendant cinq jours. La coloration avec des spécificités de souris CD-31 anticorps montre que le réseau cellulaire endothélial du centre rénal greffé à CAM est plus étendu que dans le contrôle latéral gauche. Dans la figure C, nous voyons que les vaisseaux sanguins de souris tachés avec la souris spécifique CD-31 anticorps et c’est le plus avec les vaisseaux sanguins de poulet.

Les figures D et E montrent des cryosections de reins embryonnaires de souris cultivés sur la culture de voyage ou cam de poulet pendant cinq jours et tachés avec CD-31 et Hoechst. La vasculature glomeruli est plus mature dans les reins cultivés sur le poulet CAM que dans les cultures de contrôle. La figure F montre un rein embryonnaire de souris cultivé sur cam d’un poulet transgénique de GFP pendant sept jours.

Les cellules endothéliales de souris sont tachées d’anticorps CD-31 et nous pouvons observer que la vascularisation dans les reins de souris xénotransplantés est principalement, mais pas exclusivement dérivée de la souris. La nouvelle culture de la direction fixe permet la culture des reins embryonnaires et des organoïdes à une distance limitée. Dans une culture de voyage traditionnelle, les organes cultivés sont placés sur un filtre qui est maintenu dans une interface moyenne d’air par une grille métallique.

Cette méthode permet de bonnes conditions pour le développement et la croissance, mais n’est pas optimale pour l’imagerie. Dans la culture de direction fixe, l’organe cultivé est pressé entre un fond de verre du plat et une membrane et l’épaisseur de celui-ci est contrôlée par les perles de polystyrène travaillant comme espaceurs ici. Les organes en développement peuvent être photographiés à travers le verre de couverture donnant une meilleure vue de l’organe.

Ce panneau de figure montre que les reins embryonnaires et les organoïdes rénaux peuvent être cultivés dans la méthode fixe de culture de direction réglée. Les images lumineuses de champ des reins embryonnaires et des organoïdes de rein le septième jour montrent le développement normal. Dans la figure C, l’expression GFB a été activée dans les néphrons en développement d’un organoïde rénal par la figure D montre un rein avec un traumatisme une coloration sur le bourgeon eurétrique et six deux taches marquant les cellules précurseurs du néphron.

Les figures E et F présentent le rein de souris cultivé pendant 12 jours. Le traumatisme un et la coloration du néphron montrent le bourgeon euréthrique et les podocites. Le film aussi, présente un rein embryonnaire de MTMG, Taiwan origine crie, où le cri de Taiwan induit l’expression GFB dans les cellules endothéliales.

Nous pouvons voir que les cellules endothéliales rénales sont présentes dans le rein embryonnaire en développement et le réseau endothélial peut également se développer dans la méthode de culture. Dans le panneau sur la droite, vous pouvez voir comment les cellules endothéliales migrent dans la fente vasculaire d’un néphron de stade en forme de S. Ici, nous avons présenté le protocole amélioré pour la xénotransplantation des organoïdes rénaux et des reins embryonnaires au poulet CAM.

Ce protocole augmente considérablement la survie des rudiments rénaux et aussi de leurs cellules endothéliales intrinsèques. La méthode permet le flux sanguin vers le glomerulus en développement. L’autre protocole présenté ici est la méthode fixe de culture d’organe de direction réglée qui améliore la qualité d’imagerie et aide à étudier la genèse d’organelle au niveau de cellule simple.

Les images à haute résolution conviennent à la segmentation automatisée des cellules et à l’étude informatique du comportement cellulaire chez les organoïdes rénaux et les cultures rénales.