الطريقة تسمح لنا أن نميز بوضوح التكامل بنيات بروتين اميلويد من النظراء القابلة للذوبان والمتراكمة حتى. يتم تنفيذ هذه التقنية في الجسم الحي بطريقة غير باضعة مع القليل أو لا آثار جانبية سامة. كما أنه يعتمد على خصائص الفلورسنت من الفلوروفور نفسه، فهي قوية للغاية وقابلة للتكرار مع مرور الوقت.
وقد استخدمت FLIM في مجال تشخيص السرطان. ومع ذلك، فإننا نستخدمها لدراسة الآليات الأساسية لتجميع البروتين والتي هي في الواقع ذات الصلة للأمراض العصبية. ويمكن استخدام المنهجية في مجال تجميع البروتينات.
طالما يتم وضع علامة على البروتين المرتبط بالمرض بمسبار فلوري ، يمكن تتبعه ومراقبته بمرور الوقت. ويمكن دراسة المركبات والاستراتيجيات التي تعزز أو تمنع التجميع بنجاح. أي نظام بيولوجي يسمح بأن يكون مرئياً عن طريق المجهر الضوئي هو مناسب ل FLIM إما في الجسم الحي أو السابقين في الجسم الحي ، على سبيل المثال في زراعة الخلية ، في عينات مثبّتة أو مثبّتة وفي أي وسيلة ضرورية.
تأكد من اختبار خصائص الفلوروفور المحدد داخل النياتودا قبل الحصول على بيانات تجريبية واختبار أن الإعداد يعمل بكامل طاقته قبل الحصول على القياسات. لبدء، وتنمو والحفاظ على الديدان الخيطية في 20 درجة مئوية على لوحات NGM. سن الديدان الخيطية حتى اليوم الرابع من الحياة كبالغين صغار واليوم الثامن من الحياة كبالغين كبار السن.
في يوم التصوير، ابدأ بإعداد شرائح التصوير. مكان agarose ومزدوجة الماء المقطر بتركيز 3٪ الوزن من حيث الحجم. نقله إلى ميكروويف لتذوب ثم ندعه يبرد قليلا.
قطع غيض من ماصة ملليلتر واحد واتخاذ ما يقرب من 200 ميكرولترات من agarose ذاب. الماصات agarose على شريحة زجاجية نظيفة ووضع على الفور ثانية واحدة على رأس تجنب تشكيل أي فقاعات. اترك الشرائح لتجف وأزل الشريحة الزجاجية العلوية برفق.
والنتيجة هي شريحة زجاجية مع سطح agarose حتى حيث سيتم وضع الديدان الخيطية. مرة واحدة في إعداد التصوير جاهز للاستخدام، والعمل تحت مجهر ستيريو، ووضع قطرة 10 ميكرولتر من مجمع مخدر على وسادة agarose ونقل بلطف خمسة إلى 10 الديدان الخيطية في ذلك. استخدم طرف رمش لفصل الديدان الخيطية.
الاحتفاظ بها قريبة من بعضها البعض ولكن لا تلمس للسماح لتسهيل توطين الديدان الخيطية أثناء الحصول على صورة. تراكب بعناية النيماتودا مع غطاء. في غضون ساعة واحدة بعد تركيب، واتخاذ القياسات.
تأكد من أن الديدان الخيطية غير متحركة تماماً. افتح برنامج اقتناء FLIM. حدد موقع زر علامة التبويب واضغط على مخرجات تمكين.
ضع الشريحة مع C.elegans المركبة على المسرح واستخدام عدسة تكبير 10X في وضع الإرسال ، قم بتعريب موضع النيماتودا على الشريحة. قم بإزالة الشريحة، والتبديل بين الهدف إلى عدسة تكبير 63X، وتطبيق وسيط الغمر المطلوب. ضع الشريحة على المسرح وتوطين الديدان الخيطية.
ابدأ في مسح العينة. حدد منطقة ذات أهمية وركز على مستوى الإسقاط الأقصى. على واجهة برنامج FLIM، معاينة عدد الفوتونات التي تم الكشف عنها.
يجب أن تكون قيمة ADC بين واحد مرات 10 إلى الرابع و واحد مرات 10 إلى الخامس. إذا لزم الأمر، قم بتحويل التركيز على مستوى مختلف أو زيادة قوة الليزر لجمع المزيد من الفوتونات. تأكد من تجنب تراكم الفوتون ولكن جمع كمية كافية من الفوتونات لخلق تناسب حياة جيدة والقياس.
في شريط القوائم، حدد علامة التبويب لتعيين معلمات الامتلاك. حدد مزامنة المسح الضوئي في للسماح للكشف عن الفوتون واحد. تعيين الامتلاك إلى مقدار محدد من الوقت أو عدد ثابت من الفوتونات.
اضغط على البدء في الحصول على. فتح البرنامج واستيراد ملفات البيانات FLIM عن طريق ملف، تحميل البيانات FLIM. تحميل جميع العينات من شرط واحد حتى لو تم الحصول عليها في جلسات مختلفة ومن تكرارات بيولوجية مختلفة.
إذا لزم الأمر، مقطع إلى إشارة nematode لكثير من FLIM صورة عبر تجزئة، مدير التجزئة. اسحب أداة الاقتصاص حول المنطقة التي تهمك حتى يتم تمييزها. بعد الانتهاء، اضغط موافق. حدد منطقة صغيرة حيث تظهر الصورة المستندة إلى الكثافة لـ C.elegans.
يظهر منحنى الاضمحلال في تلك المنطقة في نافذة الاضمحلال الكبيرة على الجانب الأيمن من الواجهة. لاستقراء العمر، في علامة التبويب البيانات، تعيين قيمة دنيا متكاملة عشوائية بين 40 إلى 300 لاستبعاد أي بكسل خافت جداً لإنتاج ملائمة جيدة. حدد الحد الأدنى للوقت و الحد الأقصى للوقت للحد من إشارة FLIM إلى هذه القيم.
لا تقم بتغيير عدد الفوتونات المسبقة من واحد. إدخال معدل التكرار في ميغاهرتز من الليزر المستخدمة أثناء الاستحواذ. إدخال قيمة الحد الأقصى لبوابة لاستبعاد كافة وحدات البكسل المشبعة.
في علامة التبويب العمر، حدد ملائمة عمومية ليتم استخدامها. لا تقم بتغيير أي معلمة أخرى باستثناء عدد التحديد الأسي إذا كان من المعروف أن اضمحلال الفلورسينسي المختار متعدد الأسية ويعرض أكثر من عمر واحد. قم بتحميل IRF عبر قائمة IRF.
لتقدير التحول IRF، حدد IRF، تقدير التحول IRF. تظهر مجموعة من القيم تلقائياً في علامة التبويب IRF. بمجرد تأسيس هذا، لا تقم بتغيير أي معلمات أخرى من علامة التبويب هذه.
بمجرد تعيين كافة المعلمات، اضغط على مجموعة بيانات ملائمة. يجب أن تتداخل الملاءمة الناتجة المميزة في خط أزرق مع كافة الأحداث. يتم الحصول على تناسب جيد عندما يتم محاذاة كافة الأحداث على طول تناسب.
انقر فوق علامة التبويب المعلمات الموجودة في القوائم اليمنى العليا من واجهة البرنامج وحدد إحصائية، المتوسط المرجح، وتحقق من أن قيمة مربع تشي أقرب ما يمكن إلى واحد. وبالتالي فإن قيمة العمر للصورة المختارة يتم الكشف عنها باعتبارها تاو واحد. تصدير أي معلومات ذات أهمية من خلال ملف، وتصدير الصور كثافة، تناسب نتيجة الجدول، والصور، المدرجات.
يتم عرض الخرائط التمثيلية لـ C.elegans التي تعبر عن Q40 المرابع العضلية في اليوم الرابع أو اليوم الثامن من الحياة هنا. كان امتداد Q أطول من IQ85 أكثر عرضة للتجميع وعرض تحول مدى الحياة fluorescence في الرسم البياني بالفعل في اليوم الرابع من الحياة. في الواقع، في اليوم الرابع، لوحظ تشكيل بؤر ل IQ85 بينما لا يزال غائبا في IQ44.
عند الشيخوخة، ومع ذلك، IQ44 عرضت أيضا تشكيل بؤر وبالتالي عمر الفلورانس مخفض. وأخيراً، لم يتم الكشف عن تكوين البؤر ولم ينخفض عمر الفلورانس في سلالة NQ40CFP. لهذه السلالة، كانت هناك فقط تغييرات خفية غير هامة لمدى حياة الفلورانس المتوسط عند الشيخوخة.
بمجرد تأسيس نموذج النيماتودا، فإن كمية الفوتون التي يتم جمعها هي الأهم للحصول على تناسب حياة جيدة. ويمكن أن يكون الأسلوب الملتصقة أكثر مع تقنيات مختلفة مثل فورستر الرنين نقل الطاقة، فريت، انتعاش الفلوريسين بعد photobleaching، FRAP، أو القياس. كل هذه التعديلات توفر معلومات إضافية عن خصائص الدراسات البروتينية وشكلها المجمع.
وضمن مجال تجميع البروتينات وداء البروتين، سمحت هذه التقنية بالتحقيق في أي انزعاج مفروض على النظام، وتوزيع أنواع بروتينية مختلفة، والاتجار بها، وبشكل عام الاختلاف وأهمية كسور البروتين القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان داخل الكائن الحي. azide الصوديوم مخدر سامة وينبغي التعامل معها مع قفازات ونظارات واقية وتخفيفها تحت غطاء الدخان. ولأن هذه التقنية تعتمد على المجهر، فمن المهم اتباع جميع التحذيرات المتعلقة بالعمل باستخدام الليزر.
