La méthode nous permet de distinguer clairement les structures intégrées des protéines amyloïdes des homologues solubles et même accumulés. La technique est exécutée in vivo d’une manière non invasive avec peu ou pas d’effets secondaires toxiques. Comme il dépend des propriétés fluorescentes du fluorophore lui-même, il est très robuste et reproductible au fil du temps.
FLIM a été utilisé dans le domaine du diagnostic du cancer. Cependant, nous l’employons pour étudier les mécanismes de base de l’agrégation des protéines qui sont en effet pertinents pour les maladies neurodégénératives. La méthodologie peut être utilisée dans le domaine de l’agrégation protéique.
Tant que la protéine associée à la maladie est étiquetée avec une sonde fluorescente, elle peut être suivie et surveillée au fil du temps. Les composés et les stratégies qui favorisent ou empêchent l’agrégation peuvent être étudiés avec succès. Tout système biologique qui permet d’être visualisé par microscopie légère convient à la FLIM in vivo ou ex vivo, par exemple dans la culture cellulaire, dans les échantillons fixated ou permeabilized et dans n’importe quel milieu nécessaire.
Assurez-vous de tester les propriétés de votre fluorophore sélectionné dans le nématode avant d’obtenir des données expérimentales et de tester que la configuration est entièrement fonctionnelle avant d’acquérir des mesures. Pour commencer, cultivez et maintenez les nématodes à 20 degrés Celsius sur les plaques NGM. Age les nématodes jusqu’au quatrième jour de la vie que les jeunes adultes et le huitième jour de la vie que les adultes âgés.
Le jour de l’imagerie, commencez par préparer les diapositives d’imagerie. Placer l’agarose et l’eau distillée double à une concentration de 3% de poids en volume. Transférer dans un four à micro-ondes pour faire fondre, puis laisser refroidir légèrement.
Couper la pointe d’une pointe de pipette d’un millilitre et prendre environ 200 microlitres de l’agarose fondue. Pipette l’agarose sur une glissière de verre propre et placez immédiatement une deuxième sur le dessus en évitant la formation de bulles. Laissez sécher les glissières et retirez délicatement la glissière supérieure en verre.
Le résultat est une glissade en verre avec une surface même agarose où les nématodes seront positionnés. Une fois que la configuration d’imagerie est prête à l’emploi, travaillant sous un microscope stéréo, placez une goutte de 10 microlitres de composé anesthésique sur un tampon d’agarose et transférez doucement cinq à 10 nématodes dedans. Utilisez une pointe de cils pour séparer les nématodes.
Gardez-les proches les uns des autres mais ne touchant pas pour permettre une localisation plus facile des nématodes lors de l’acquisition d’images. Superposer soigneusement les nématodes avec un coverslip. Moins d’une heure après le montage, prendre des mesures.
Assurez-vous que les nématodes sont complètement immobiles. Ouvrez le logiciel d’acquisition FLIM. Localisez le bouton onglet et appuyez sur activer les sorties.
Placez la glissière avec le C.elegans monté sur la scène et à l’aide d’un objectif de grossissement 10X en mode transmission, localisez la position des nématodes sur la diapositive. Retirez la glissière, passez l’objectif à un objectif de grossissement 63X et appliquez le milieu d’immersion requis. Placez la glissade sur la scène et localisez les nématodes.
Commencez à numériser l’échantillon. Sélectionnez une région d’intérêt et concentrez-vous sur son plan de projection maximum. Sur l’interface du logiciel FLIM, prévisualisez le nombre de photons détectés.
La valeur ADC doit être entre une fois 10 à la quatrième et une fois 10 à la cinquième. Si nécessaire, déplacez l’accent sur un plan différent ou augmentez la puissance laser pour recueillir plus de photons. Assurez-vous d’éviter le carambolage photon, mais de recueillir une quantité suffisante de photons pour créer un bon ajustement et la mesure à vie.
Dans la barre de menu, sélectionnez l’onglet pour définir les paramètres d’acquisition. Sélectionnez la synchronisation d’analyse pour permettre la détection d’un seul photon. Définissez l’acquisition à un temps fixe ou à un nombre fixe de photons.
Appuyez sur commencer l’acquisition. Ouvrez le logiciel et importez des fichiers de données FLIM via le fichier, chargez les données FLIM. Chargez tous les échantillons à partir d’une seule condition, même s’ils sont obtenus dans différentes sessions et à partir de différentes répétitions biologiques.
Si nécessaire, segment à signaler nématode pour de nombreuses images FLIM via segmentation, gestionnaire de segmentation. Faites glisser l’outil de culture autour de la zone d’intérêt jusqu’à ce qu’il soit mis en évidence. Une fois terminé, appuyez sur OK. Sélectionnez une petite région où apparaît l’image basée sur l’intensité d’un C.elegans.
La courbe de décomposition de cette région apparaît dans la grande fenêtre de décomposition sur le côté droit de l’interface. Pour extrapoler la durée de vie, sur l’onglet données, définissez une valeur minimale intégrée arbitraire entre 40 et 300 pour exclure tous les pixels trop faibles pour produire un bon ajustement. Sélectionnez un minimum de temps et un nombre maximum de temps pour limiter le signal FLIM à ces valeurs.
Ne modifiez pas le photon de dénombrement prédéfinis d’un. Entrez le taux de répétition dans le mégahertz du laser utilisé lors de l’acquisition. Entrez une valeur maximale de porte pour exclure tous les pixels saturés.
Sur l’onglet durée de vie, sélectionnez un raccord global à utiliser. Ne modifiez aucun autre paramètre, sauf le nombre de sélection exponentielle s’il est connu que la désintégration de fluorescence choisie est multi-exponentielle et présente plus d’une seule durée de vie. Téléchargez l’IRF via le menu IRF.
Pour estimer le décalage IRF, sélectionnez IRF, estimer le décalage IRF. Un ensemble de valeurs s’affiche automatiquement sur l’onglet IRF. Une fois que cela est établi, ne modifiez pas d’autres paramètres de cet onglet.
Une fois que tous les paramètres sont définis, appuyez sur l’ensemble de données d’ajustement. L’ajustement résultant mis en évidence dans une ligne bleue devrait se chevaucher avec tous les événements. Un bon ajustement est obtenu lorsque tous les événements sont alignés le long de l’ajustement.
Cliquez sur l’onglet paramètres situé dans les menus en haut à droite de l’interface du logiciel et sélectionnez statistique, moyenne pondérée, et vérifiez que la valeur carrée chi est aussi proche que possible d’un. La valeur à vie de l’image sélectionnée est ainsi révélée comme tau one. Exportez toute information d’intérêt par le biais de fichiers, d’images d’intensité d’exportation, d’une table de résultats adaptée, d’images, d’histogrammes.
Des cartes représentatives de C.elegans exprimant la DP Q40 musclée le quatrième jour ou le huitième jour de la vie sont présentées ici. Le tronçon Q plus long de l’IQ85 était plus enclin à l’agrégation et a montré un décalage à vie de fluorescence dans l’histogramme déjà au quatrième jour de la vie. En fait, au quatrième jour, la formation de foyers a été observée pour IQ85 alors qu’il était encore absent dans IQ44.
Sur le vieillissement, cependant, IQ44 a également montré la formation de foyers et donc une durée de vie réduite de fluorescence. Enfin, la formation de foyers n’a pas été détectée et n’a pas diminué la durée de vie de fluorescence dans la souche NQ40CFP. Pour cette souche, il n’y avait que des changements subtils non significatifs à la durée de vie moyenne de fluorescence au vieillissement.
Une fois que le modèle nématode est établi, la quantité de photons recueillis est primordiale pour obtenir un bon ajustement à vie. La méthode peut être davantage conjointe avec différentes techniques telles que le transfert d’énergie de résonance de Forster, fret, récupération de fluorescence après photobleaching, FRAP, ou mesure. Toutes ces adaptations fournissent des informations supplémentaires sur les propriétés des études protéiques et sa forme agrégée.
Dans le domaine de l’agrégation protéique et de l’homéostasie protéique, la technique a permis d’étudier toute perturbation imposée au système, la distribution de différentes espèces de protéines, et le trafic et en général la différence et l’importance des fractions de protéines solubles et insolubles au sein de l’organisme vivant. L’azide de sodium anesthésique est toxique et doit être manipulé avec des gants et des lunettes et dilué sous une hotte de fumée. Parce que la technique est basée sur la microscopie, il est important de suivre tous les avertissements liés au travail avec les lasers.
