השיטה מאפשרת לנו להבחין בבירור בין מבני חלבון עמילואיד משולבים לבין המקבילים המסיסים ואף המצטברים. הטכניקה מבוצעת ב vivo באופן פולשני עם מעט או ללא תופעות לוואי רעילות. כפי שהוא תלוי במאפיינים הפלואורסצנטיים של הפלואורופור עצמו, הוא חזק מאוד והתרבות לאורך זמן.
FLIM נוצל בתחום אבחון סרטן. עם זאת, אנו מעסיקים אותו כדי ללמוד את המנגנונים הבסיסיים של צבירת חלבונים אשר אכן רלוונטיים למחלות ניווניות. המתודולוגיה יכולה לשמש בתחום צבירת החלבון.
כל עוד החלבון הקשור למחלה מתויג עם בדיקה פלואורסצנטית, ניתן לעקוב אחריו ולנטר אותו לאורך זמן. ניתן ללמוד בהצלחה תרכובות ואסטרטגיות המקדמות או מונעות צבירה. כל מערכת ביולוגית המאפשרת להיות חזותית על ידי מיקרוסקופיה אור מתאים FLIM או vivo או ex vivo, למשל בתרבות התא, בדגימות מקובעות או מחלחלות ובכל מדיום הכרחי.
הקפד לבדוק את המאפיינים של הפלואורופור שבחרת בתוך nematode לפני קבלת נתונים ניסיוניים כדי לבדוק כי ההתקנה מתפקדת באופן מלא לפני רכישת מדידות. כדי להתחיל, לגדול ולתחזק nematodes ב 20 מעלות צלזיוס על לוחות NGM. גיל nematodes עד היום הרביעי של החיים כמו הצעירים ואת היום השמיני של החיים כמו המבוגרים.
ביום ההדמיה, התחל בהכנת שקופיות ההדמיה. מניחים אגרוז ומים מזוקקים כפולים בריכוז של 3% משקל לפי נפח. מעבירים אותו למיקרוגל כדי להמיס ולאחר מכן נותנים לו להתקרר מעט.
חותכים את הקצה של קצה פיפיטר אחד מיליליטר ולקחת בערך 200 microliters של אגרוז נמס. פיפטה התעוררה על מגלשת זכוכית נקייה ומיד מניחה שנייה על גבי הימנעות היווצרות של בועות כלשהן. השאר את השקופיות להתייבש בעדינות להסיר את החלק העליון זכוכית.
התוצאה היא מגלשת זכוכית עם משטח אפילו agarose שבו nematodes יהיה ממוקם. לאחר הגדרת ההדמיה מוכנה לשימוש, עובד תחת מיקרוסקופ סטריאו, מניחים טיפה 10 microliter של תרכובת הרדמה על כרית אגרוז בעדינות להעביר חמישה עד 10 nematodes לתוכו. השתמש בקצה עפעף כדי להפריד את nematodes.
שמור אותם קרוב זה לזה אך לא נוגע כדי לאפשר לוקליזציה קלה יותר של nematodes במהלך רכישת תמונה. בזהירות כיסוי nematodes עם כיסוי. תוך שעה לאחר ההרכבה, יש ליי לקחת מדידות.
ודא nematodes הם חסרי תנועה לחלוטין. פתח את תוכנת הרכישה של FLIM. אתר את לחצן הכרטיסיה ולחץ על הפוך פלט לזמין.
מקם את השקופית עם C.elegans רכוב על הבמה באמצעות עדשת הגדלה 10X במצב שידור, לוקליזציה את המיקום של nematodes על השקופית. הסר את השקופית, העבר את המטרה לעדשת הגדלה של פי 63 והחל את מדיום הטבילה הנדרש. מקם את השקופית על הבמה והפוך את הנומטודות לאוקליזציה.
תתחיל לסרוק את הדגימה. בחר אזור מעניין והתמקד במישור ההקרנה המרבי שלו. בממשק של תוכנת FLIM, הצג בתצוגה מקדימה את מספר הפוטונים שזוהו.
ערך ה- ADC צריך להיות בין 10 ל- 10 לערך הרביעי וערך אחד 10 עד החמישי. במידת הצורך, הסט את המיקוד במישור אחר או הגדל את כוח הלייזר כדי לאסוף יותר פוטונים. הקפד להימנע ערימת פוטון אבל לאסוף כמות מספקת של פוטונים כדי ליצור התאמה חיים טובה ומדידה.
שורת התפריטים, בחר בכרטיסיה כדי להגדיר את פרמטרי הרכישה. בחר סינכרון סריקה כדי לאפשר זיהוי פוטון יחיד. הגדר את הרכישה לכמות קבועה של זמן או למספר קבוע של פוטונים.
לחץ להתחיל ברכישה. לפתוח את התוכנה ולייבא קבצי נתונים FLIM באמצעות קובץ, לטעון נתוני FLIM. טען את כל הדגימות מתנאי אחד גם אם הושג בפגישות שונות וחוזר ביולוגי שונה.
במידת הצורך, פלח כדי לאותת nematode עבור תמונת FLIM רבים באמצעות פילוח, מנהל פילוח. גררו את כלי החיתוך מסביב לאזור העניין עד שיסומן. לאחר השלמת הפעולה, לחץ על אישור. בחרו אזור קטן שבו מופיעה תמונה מבוססת עוצמה של C.elegans.
עקומת הריקבון של אזור זה מופיעה בחלון הריקבון הגדול בצד ימין של הממשק. כדי לשער את אורך החיים, בכרטיסיה נתונים, הגדר ערך מינימלי משולב שרירותי בין 40 ל- 300 כדי לא לכלול פיקסלים עמומים מכדי להפיק התאמה טובה. בחר מספר זמן מינימלי ומקסימום זמן כדי להגביל את אות FLIM לערכים אלה.
אל תשנה את הקבעה המוגדרת מראש סופר פוטון של אחד. הזן את שיעור החזרה במגה-הרץ של הלייזר המשמש במהלך הרכישה. הזן ערך מרבי של שער כדי לא לכלול את כל הפיקסלים הרוויים.
בכרטיסיה אורך חיים, בחר התאמה כלליה לשימוש. אל תשנה פרמטר אחר מלבד מספר הבחירה המעריכית אם ידוע כי ריקבון הפלואורסצנטיות שנבחר הוא רב-מעריכי ומציג יותר מחיים שלמים. העלה את ה- IRF באמצעות תפריט IRF.
כדי להעריך את הסטת ה- IRF, בחר IRF, היסוף העברת IRF. קבוצת ערכים מופיעה באופן אוטומטי בכרטיסיה IRF. לאחר שכך נוצר, אל תשנה פרמטרים אחרים של כרטיסיה זו.
לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על התאם ערכת נתונים. מתאים וכתוצאה מכך מסומן בקו כחול צריך לחפוף עם כל האירועים. התאמה טובה מתקבלת כאשר כל האירועים מיושרים לאורך מתאים.
לחץ על כרטיסיית הפרמטרים הממוקמת בתוך התפריטים השמאליים העליונים של ממשק התוכנה ובחר ממוצע סטטיסטי משוקלל ובדוק שהערך הריבועי של הצ'י קרוב ככל האפשר לערך. ערך החיים של התמונה שנבחרה מתגלה כך כערך טאו אחד. יצא כל מידע מעניין באמצעות קובץ, לייצא תמונות בעוצמה, להתאים את טבלת התוצאות, תמונות, היסטוגרמות.
מפות מייצגות של C.elegans המביעים שרירי Q40 RFP ביום הרביעי או יום שמונה של החיים מוצגים כאן. מתיחת Q הארוכה יותר של ה- IQ85 הייתה נוטה יותר לצבירה והפגינו שינוי חיים פלואורסצנטי בהיסטוגרמה כבר ביום הרביעי לחיים. למעשה, ביום הרביעי, היווצרות foci נצפתה עבור IQ85 בעוד עדיין נעדר IQ44.
עם ההזדקנות, עם זאת, IQ44 הפגין גם היווצרות מוקדי ובכך חיים פלואורסצנטיים מופחתים. לבסוף, היווצרות foci לא זוהה ולא ירד אורך החיים פלואורסצנטי בזן NQ40CFP. עבור זן זה, היו רק שינויים עדינים ולא משמעותיים לכל החיים הפלואורסצנטיים הממוצעים עם ההזדקנות.
לאחר המודל nematode הוקמה, כמות הפוטון שנאסף הוא בעל חשיבות עליונה כדי להשיג התאמה טובה לכל החיים. השיטה יכולה להיות סיוב עוד יותר עם טכניקות שונות כגון העברת אנרגיה תהודה פורסטר, FRET, התאוששות פלואורסצנטיות לאחר photobleaching, FRAP, או מדידה. כל ההתאמות הללו מספקות מידע נוסף על תכונות מחקרי החלבון וצורתו המצטברת.
בתחום צבירת החלבון והונוסטזיס החלבון, הטכניקה אפשרה לחקור כל הפרעה המוטלת על המערכת, התפלגות מיני חלבון שונים, ואת הסחר ובהחלט את ההבדל והמשמעות של שברי חלבון מסיסים ובלתי מסיסים בתוך האורגניזם החי. נתרן אזיד הרדמה הוא רעיל ויש לטפל בו עם כפפות ומ המשקפיים ומדולל מתחת למכסה המנוע של האדים. מכיוון שהטכניקה מבוססת מיקרוסקופיה, חשוב לעקוב אחר כל האזהרות הקשורות לעבודה עם לייזרים.
