O método permite distinguir claramente estruturas integradas de proteína amiloide das contrapartes solúveis e até acumuladas. A técnica é realizada in vivo de forma não invasiva, com pouco ou nenhum efeito colateral tóxico. Como depende das propriedades fluorescentes do próprio fluorohore, é altamente robusto e reprodutível ao longo do tempo.
A FLIM tem sido utilizada no campo do diagnóstico de câncer. No entanto, nós o utilizamos para estudar os mecanismos básicos de agregação de proteínas que são de fato relevantes para doenças neurodegenerativas. A metodologia pode ser utilizada no campo da agregação de proteínas.
Enquanto a proteína associada à doença for marcada com uma sonda fluorescente, ela pode ser rastreada e monitorada ao longo do tempo. Compostos e estratégias que promovam ou previnem a agregação podem ser estudados com sucesso. Qualquer sistema biológico que permita ser visualizado por microscopia leve é adequado para FLIM in vivo ou ex vivo, por exemplo, na cultura celular, em amostras fixadas ou permeabilizadas e em qualquer meio necessário.
Certifique-se de testar as propriedades do fluorohore selecionado dentro do nematoide antes de obter dados experimentais e testar se a configuração está totalmente funcional antes de adquirir medições. Para começar, cresça e mantenha nematoides a 20 graus Celsius em placas de NGM. Envelhecer os nematoides até o quarto dia da vida como os jovens adultos e o oitavo dia de vida como os idosos.
No dia da imagem, comece preparando os slides de imagem. Coloque agarose e dupla água destilada com uma concentração de 3% de peso em volume. Transfira para um micro-ondas para derreter e deixe esfriar um pouco.
Corte a ponta de uma ponta de pipeta de um mililitro e pegue cerca de 200 microliters da agarose derretida. Pipeta a ága subiu em um escorregador de vidro limpo e imediatamente colocar um segundo em cima evitando a formação de quaisquer bolhas. Deixe os slides secarem e retire delicadamente o deslizamento de vidro superior.
O resultado é um deslizamento de vidro com uma superfície ainda agarose onde os nematoides serão posicionados. Uma vez que a configuração de imagem esteja pronta para uso, trabalhando sob um microscópio estéreo, coloque uma gota de 10 microliter de composto anestésico em uma almofada de agarose e transfira suavemente de cinco a 10 nematoides para ele. Use uma ponta de cílios para separar os nematoides.
Mantenha-os juntos, mas não toque para permitir uma localização mais fácil dos nematoides durante a aquisição de imagens. Sobreponha cuidadosamente os nematoides com uma mancha de cobertura. Dentro de uma hora após a montagem, faça medições.
Certifique-se de que os nematoides estão completamente imóveis. Abra o software de aquisição da FLIM. Localize o botão de guia e pressione ativar saídas.
Coloque o slide com os C.elegans montados no palco e usando uma lente de ampliação de 10X no modo de transmissão, localize a posição dos nematoides no slide. Remova o slide, mude o objetivo para uma lente de ampliação de 63X e aplique o meio de imersão necessário. Coloque o slide no palco e localize os nematoides.
Comece a digitalizar a amostra. Selecione uma região de interesse e foque em seu plano de projeção máxima. Na interface do software FLIM, visualize o número de fótons detectados.
O valor da ADC deve ser entre uma vez 10 a 10 e uma vez 10 para a quinta. Se necessário, mude o foco em um plano diferente ou aumente a potência do laser para coletar mais fótons. Certifique-se de evitar o acúmulo de fótons, mas colete uma quantidade suficiente de fótons para criar um bom ajuste e medição ao longo da vida.
Na barra de menu, selecione a guia para definir os parâmetros de aquisição. Selecione a sincronização de varredura para permitir a detecção de fótons únicos. Defina a aquisição para um período fixo de tempo ou um número fixo de fótons.
A imprensa começa a ser aquisição. Abra o software e importe arquivos de dados FLIM via arquivo, carregue dados FLIM. Carregue todas as amostras de uma condição, mesmo se obtidas em sessões diferentes e de diferentes repetições biológicas.
Se necessário, segmento para sinalizar nematoide para muitas imagens FLIM via segmentação, gerente de segmentação. Arraste a ferramenta de corte ao redor da área de interesse até que ela seja destacada. Uma vez concluída, pressione OK. Selecione uma pequena região onde a imagem baseada em intensidade de um C.elegans aparece.
A curva de decomposição dessa região aparece na grande janela de decomposição no lado direito da interface. Para extrapolar a vida útil, na guia de dados, defina um valor mínimo integrado arbitrário entre 40 e 300 para excluir quaisquer pixels que sejam muito fracos para produzir um bom ajuste. Selecione um número mínimo de tempo e um número máximo de tempo para limitar o sinal FLIM a esses valores.
Não altere o fóton predefinido de um. Insira a taxa de repetição em mega-hertz do laser utilizado durante a aquisição. Insira um valor máximo do portão para excluir todos os pixels saturados.
Na guia lifetime, selecione um ajuste global a ser usado. Não altere nenhum outro parâmetro, exceto o número de seleção exponencial se soube-se que a decadência da fluorescência escolhida é multi-exponencial e exibe mais de uma única vida útil. Faça upload do IRF através do menu IRF.
Para estimar o turno do IRF, selecione IRF, estime o deslocamento do IRF. Um conjunto de valores aparece automaticamente na guia IRF. Uma vez estabelecido, não altere nenhum outro parâmetro desta guia.
Uma vez definidos todos os parâmetros, pressione o conjunto de dados de ajuste. O ajuste resultante destacado em uma linha azul deve se sobrepor a todos os eventos. Um bom ajuste é obtido quando todos os eventos estão alinhados ao longo do ajuste.
Clique na guia parâmetros localizada dentro dos menus superiores certos da interface do software e selecione estatística, média ponderada e verifique se o valor do quadrado chi está o mais próximo possível de um. O valor vitalício da imagem selecionada é, portanto, revelado como tau um. Exporte qualquer informação de interesse através de arquivo, imagens de intensidade de exportação, tabela de resultados de ajuste, imagens, histogramas.
Mapas representativos de C.elegans expressando rfp muscular Q40 no quarto ou oitavo dia de vida são mostrados aqui. O trecho Q mais longo do QI85 foi mais propenso à agregação e exibiu uma mudança de vida fluorescência no histograma já no quarto dia da vida. De fato, no quarto dia, observou-se formação de focos para QI85 enquanto ainda estava ausente no QI44.
Após o envelhecimento, no entanto, o IQ44 também apresentou formação de focos e, portanto, uma vida de fluorescência reduzida. Finalmente, a formação de focos não foi detectada nem diminuiu a vida útil da fluorescência na cepa NQ40CFP. Para esta cepa, houve apenas mudanças sutis não significativas na vida média da fluorescência ao envelhecer.
Uma vez estabelecido o modelo de nematoide, a quantidade de fóton coletado é primordial para obter um bom ajuste vitalício. O método pode ser ainda mais associado a diferentes técnicas como transferência de energia de ressonância forster, FRET, recuperação de fluorescência após fotobleaching, FRAP ou medição. Todas essas adaptações fornecem informações extras sobre as propriedades dos estudos proteicos e sua forma agregada.
No campo da agregação de proteínas e da homeostase proteica, a técnica permitiu investigar qualquer perturbação imposta ao sistema, a distribuição de diferentes espécies proteicas e o tráfico e, em geral, a diferença e significância de frações proteicas solúveis e insolúveis dentro do organismo vivo. O azida de sódio anestésico é tóxico e deve ser manuseado com luvas e óculos e diluído sob um capô de fumaça. Como a técnica é baseada em microscopia, é importante seguir todos os avisos relacionados ao trabalho com lasers.
