في التهجين في الموقع هو تقنية مفيدة جدا لتقديم أنماط التعبير مررنا و IncRNA من جينات محددة في الأنسجة. هدفنا في هذه المقالة هو تطوير طريقة حساسة للكشف عن توطين مرنا محددة في السائل coelomic من نوكلوس Sipunculus، وهو مورد السمكية الحاسمة. لقد عرضنا النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها من تجاربنا الناجحة باستخدام هذه الطريقة.
ومن المؤمل أن يتم تطبيق طريقتنا على الأنواع الأخرى من Sipuncula لتحديد أنماط التعبير من مرنا وشركة RNA محددة في السائل coelomic. إصلاح الـ Sipunculus nudus على طاولة التشريح. فتح الجسم من nudus Sipunculus مع مقص autoclaved الصغيرة.
ثم جمع ونقل السائل coelomic مع ماصة إلى بولي D-ليسين يعامل شرائح المجهر، وانتشار أقل ما يقال. الهواء الجافة الشرائح لمدة ساعة في 37 درجة مئوية. غسل الشرائح مع DEPC-PBS لمدة ثلاث مرات، خمس دقائق لكل غسل مع التحريض لطيف.
استنزاف برنامج تلفزيوني، إضافة محلول البروتينات K على الشرائح لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنزاف محلول البروتينات K. أضف حل PFA على الشرائح لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
استنزاف حل PFA. غسل الشرائح مع DEPC-PBS لمدة ثلاث مرات، خمس دقائق لكل غسل مع التحريض لطيف. استنزاف برنامج تلفزيوني.
إضافة 50 ميكرولتر ريبوبروب. إضافة غطاء. وضع الشرائح في مربع الرطب وختم جيدا مع فيلم البارافين.
التهجين بين عشية وضحاها في 60 درجة مئوية. اغمر الشرائح في مخزن الغسيل واتركه قائماً حتى تنزلق الأغطية تلقائيًا. اغسل الشرائح مع عازلة الغسيل المُحمّى مسبقاً مرتين عند درجة 65 درجة مئوية، 30 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف.
اغسل الشرائح بمحلول SSC المُحمّى مسبقًا مرتين بمعدل 65 درجة مئوية، و30 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف. اغسل الشرائح بمحلول MABT مرتين في درجة حرارة الغرفة. 30 دقيقة لكل غسل مع التحريض لطيف.
استنزاف MABT. إضافة المخزن المؤقت للحظر. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث إلى أربع ساعات.
استنزاف العازلة حظر. إضافة الأجسام المضادة، احتضان الشرائح في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. استنزاف حل الأجسام المضادة.
اغسل الشرائح بمحلول MABT لمدة أربع مرات، و25 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف. استنزاف MABT. إضافة العازلة فوسفاتيز القلوية لمدة ثلاث مرات، خمس دقائق لكل حضانة.
إزالة العازلة فوسفاتاتيز القلوية. أضف حل تلطيخ BCIP-NBT. إبقاء الشرائح في الظلام.
يختلف وقت التلطيخ من دقائق إلى ساعات، حتى خلال الليل، والذي يعتمد على شدة الإشارة. وينبغي التحقق من حالة تلطيخ أكثر تواترا في بداية تلطيخ. على سبيل المثال، مع فاصل زمني من عدة دقائق، وعدة ساعات على الأكثر من تلطيخ.
وينبغي أن يكون وقت التدقيق قصيراً بقدر ما يمكن أن يكون لتجنب إدخال إشارات خلفية عالية بسبب التعرض للضوء. وتظهر الإشارات التمثيلية للتهجين في الموقع. في التهجين في الموقع من السائل النخاعي nudus coelomic مع ريبوبروفب المضادة للحس الذي يستهدف dmrt1 يشير إلى تلطيخ الأرجواني تتركز في الخلايا التروبوبلاست من spermatozeugmata، الشكل 2A وB.Sense ريبوبروفب ل dmrt1 لم يكشف أي إشارة التهجين، الشكل 2C.
بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد جدا لكيفية تصور أنماط التعبير من الحمض النووي الريبي الهدف أو IncRNA في السائل coelomic من سيبو.
