La hibridación in situ es una técnica muy informativa para presentar patrones de expresión de ARNm e IncRNA de genes específicos en tejidos. Nuestro propósito en este artículo es desarrollar un método sensible para detectar la localización específica del ARNm en el líquido coelomico de Sipunculus nudus, que es un recurso pesquero crucial. Hemos presentado los resultados representativos obtenidos de nuestros experimentos exitosos mediante el uso de este método.
Se espera que nuestro método se aplique a otras especies de Sipuncula para identificar los patrones de expresión del ARNm específico y el IncRNA en fluido coelomico. Fije el Nudus de Sipunculus en la tabla de disección. Abra el cuerpo del Nudus Sipunculus con pequeñas tijeras autoclaves.
A continuación, recoger y transferir el líquido coelomic con pipeta a diapositivas de microscopio tratadas con poli-D-lisina, se extienden ligeramente. Seque al aire los portaobjetos durante una hora a 37 grados Centígrados. Lave los portaobjetos con DEPC-PBS tres veces, cinco minutos por lavado con agitación suave.
Escurrir el PBS, añadir la solución de proteinasa K en los portaobjetos durante cinco minutos a temperatura ambiente. Escurra la solución de proteinasa K. Agregue la solución PFA en los portaobjetos durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Escurra la solución PFA. Lave los portaobjetos con DEPC-PBS tres veces, cinco minutos por lavado con agitación suave. Escurra el PBS.
Añadir 50 microlitrolidor riboprobe. Agregue un cubreobjetos. Coloque las diapositivas en la caja húmeda y selle bien con película de parafina.
Hibridar durante la noche a 60 grados Celsius. Sumerja las diapositivas en el tampón de lavado y déjela reposar hasta que el cubreobjetos se deslice automáticamente. Lave los portaobjetos con el tampón de lavado precalentado dos veces a 65 grados Celsius, 30 minutos por lavado con agitación suave.
Lave los portaobjetos con la solución SSC precalentada dos veces a 65 grados Celsius, 30 minutos por lavado con agitación suave. Lave los portaobjetos con la solución MABT dos veces a temperatura ambiente. 30 minutos por lavado con agitación suave.
Escurra el MABT. Agregue el búfer de bloqueo. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante tres a cuatro horas.
Va drain el búfer de bloqueo. Añadir el anticuerpo, incubar los portaobjetos a cuatro grados Celsius durante la noche. Escurra la solución de anticuerpos.
Lave los portaobjetos con la solución MABT durante cuatro veces, 25 minutos por lavado con agitación suave. Escurra el MABT. Agregue el tampón de fosfatasa alcalina tres veces, cinco minutos por incubación.
Retire el búfer de fosfatasa alcalina. Agregue la solución de tinción BCIP-NBT. Mantenga las diapositivas en la oscuridad.
El tiempo de tinción varía de minutos a horas, incluso durante la noche, lo que depende de la intensidad de la señal. El estado de tinción debe comprobarse con más frecuencia al principio de la tinción. Por ejemplo, con un intervalo de varios minutos, y varias horas a más tardar de la tinción.
El tiempo de comprobación debe ser tan corto como puede ser para evitar la introducción de una alta señalización de fondo debido a la exposición a la luz. Se muestran las señales representativas de la hibridación in situ. La hibridación in situ del líquido coelomico Sipunculus nudus con riboprobe antien sentido que se dirige a dmrt1 indica tinción púrpura concentrada en células trofoblastas del espermatozoide, figura 2A y B.Sense riboprobe para dmrt1 no detectó ninguna señal de hibridación, figura 2C.
Después de ver este video, usted tendría una muy buena comprensión de cómo visualizar los patrones de expresión del ARNm objetivo o IncRNA en el líquido coelomico de Sipunculus nudus.
