بروتوكولنا في الموقع مهم لأنه يوفر طريقة مباشرة لتصور أنماط التعبير الجيني مع الحد الأدنى من تلطيخ الخلفية. هذه التقنية يجعل بروتوكول معقدة وطويلة نسبيا من السهل تنفيذ. Benchtop إعداد الاقتراحات والقوائم المرجعية المقدمة تجعل هذا البروتوكول حتى أسهل لأداء بشكل صحيح وإعادة إنتاج.
في حين أن التقنيات المعروضة هنا هي محددة إلى المكسيكية Astyanax، فإنه من المرجح أن تتكيف مع أنظمة أخرى من الأفراد الحجم بالمقارنة مع تعديلات صغيرة على البروتوكول. أولاً، استخدم شريط مختبر ملون لتعيين قوارير وماصات لكل جين. باستخدام ماصة باستور، فرز الأجنة.
لا يوجد عادة أكثر من 12 جنيناً لكل قارورة، يتم فرزها بمجرد فرزها. المقبل، تعيين حمام مائي اهتزاز إلى 70 درجة مئوية. بعناية استخلاص الميثانول في قارورة من أجنة فرزها، واستبداله مع 500 ميكرولتر من الميثانول 100٪ الطازجة.
غسل الأجنة لفترة وجيزة لمدة دقيقة واحدة تقريبا على منصة شاكر. بعد ذلك، اُعاد هيدرات الأجنة بتركيز متزايد من 1x PBS مع Tween 20 على منصة شاكر كما هو موضح في بروتوكول النص. للبدء، ضع طوقاً صغيراً مع قاع شبكي في حمام الماء الدوار الذي تم تسخينه مسبقاً إلى 70 درجة مئوية.
مكان aliquots من العازلة التهجين ناقص والتخزين المؤقت بالإضافة إلى في طوقا. أضف محلول PK المعدة بلطف إلى قارورة الأجنة لضمان تغطية جميع الأنسجة بالكامل في المحلول. نقل قارورة إلى منصة شاكر والسماح لهم هضم في محلول عمل البروتينات K لمدة 12 دقيقة تقريبا.
بعد هذا، سحب بلطف قبالة حل PK والفيضانات لفترة وجيزة القارورة مع PBT لتخفيف PK المتبقية. استبدال حل PBT مع 500 ميكرولترات من PBT الطازجة والسماح للشطف الحل على منصة شاكر لمدة خمس دقائق. ثم استبدال حل PBT مع 500 ميكرولترات من 4٪ PFA المذابة. دع الأجنة تحتضن على المنصة شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
لبدء مرحلة ما قبل التهجين، إضافة 500 ميكرولترات من العازلة التهجين قبل الدفء ناقص حل إلى قارورة تحتوي على الجنين. ضع القنينات بعناية في طوقا في الحمام المائي عند درجة حرارة 70 درجة مئوية دون أن تهتز لمدة خمس دقائق. المقبل سحب قبالة العازلة التهجين ناقص الحل والفيضانات قوارير مع 500 microliters من العازلة التهجين مسبقا بالإضافة إلى حل.
ضع القنينات مرة أخرى في طوقا في الحمام المائي واحتضان مع اهتزاز إما لمدة أربع ساعات أو بين عشية وضحاها. لبدء التهجين، رسم العازلة التهجين زائد من قارورة واستبدالها مع 500 ميكرولترات من جديد قبل الدفء العازلة التهجين زائد. إضافة بعناية اثنين من ميكرولترات من المسبار RNA إلى كل قارورة ودوامة بلطف لضمان توزيع حتى من التحقيق.
احتضان في حمام مائي في 70 درجة مئوية بين عشية وضحاها بينما تهتز في 40 دورة في الدقيقة. للبدء، وإعداد أنابيب microcentrifuge المسمى العازلة التهجين بالإضافة إلى جين من مصلحة الجيش الملكي النيبالي التحقيق كما هو مبين في بروتوكول النص. تعيين اثنين من أنابيب المخروطية 15 ملليلتر وإضافة 0.2 غرام من الكاشف منع و 10 ملليلتر من مابت.
ضع كلا الأنبوبين على خلاطة المكسرات حتى يذوب الكاشف تمامًا في المحلول. باستخدام ماصة باستور الزجاج سحب قبالة العازلة التهجين بالإضافة إلى حل التحقيق ووضعها في أنبوب microcentrifuge معقم المسمى. تخزين هذا الأنبوب في الثلاجة في ناقص 20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
إضافة بعناية 500 ميكرولترات من سيترات الصوديوم المالحة الدافئة والتهجين العازلة ناقص التخفيف. احتضان في حلول متتابعة لمدة 10 دقائق كل في حمام الماء تهتز، ومن ثم في درجة حرارة الغرفة على منصة شاكر كما هو مبين في بروتوكول النص. بعد الحضانة الأخيرة، استبدال PBT 100٪ من كل قارورة مع 500 ميكرولترers من مابت.
كرر هذه العملية مرتين لمدة خمس دقائق لكل من هذه. أولاً، قم بإزالة MABT من كل قارورة وغمرها بمحلول الحجب المائل من أحد الأنابيب المخروطية ذات الـ 15 ملليلتر. ضع كل من القنينات على خلاط المكسرات لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة.
إضافة اثنين microliters من شظايا الأجسام المضادة إلى أنبوب الثاني من محلول الحجب المعدة ودوامة لفترة وجيزة. ثم ملء كل قارورة تماما تقريبا مع حل منع ووضعها على خلاط nutating بين عشية وضحاها في ثلاجة في أربع درجات مئوية. للبدء، إعداد قارورة الأسهم من 10٪ NGS في MABT.
استبدل حل الحجب في كل قارورة بـ 500 ميكرولترات من هذا الحل NGS. احتضان في درجة حرارة الغرفة على منصة شاكر لمدة 25 دقيقة. بعد ذلك، استبدل خليط NGS بـ 500 ميكروليتر من 100٪ مابت.
احتضان على منصة شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. كرر هذا شطف 11 مرة أخرى على مدار اليوم، كل 30 دقيقة. ثم ملء كل قارورة مع 100٪ MABT ووضعها على خلاط nutating بين عشية وضحاها في ثلاجة في أربع درجات مئوية.
أولاً، استبدل مابت في كل قارورة بميليلتر واحد من مخزن AP المؤقت واتركه يغسل لمدة خمس دقائق. كرر هذا الغسيل مرتين لإزالة مابت تماما. ثم استبدال المخزن المؤقت AP مع ملليلتر واحد من المخزن المؤقت AP الطازجة التي تحتوي على 3.5 ميكرولترات من BCIP و 4.5 ميكرولترات من MBT.
استبدل هذا بمزيج جديد من المخزن المؤقت AP يحتوي على BCIP و MBT كل ساعة حتى يكتمل التفاعل ، مع التأكد من مراقبة التفاعل عن كثب والتحقق من كل 15 دقيقة حتى يتم تحقيق المستوى المطلوب من التلوين. وقف رد فعل تلوين عن طريق شطف الأجنة في تركيز متزايد من 1X PBT في العازلة AP كما هو مبين في البروتوكول. شطف الأجنة في ما يقرب من خمسة ملليلتر من 100٪ PBT على خلاط nutating حتى يتم التوصل إلى الحد الأدنى المطلوب تلطيخ الخلفية.
عندما يكتمل الشطف ، قم بغسل الأجنة في 500 ميكرولترات من PBS العقيمة على شاكر منصة و postfix العينات كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد شطف الأجنة، ووضعها في أربعة ملليلتر من 100٪ برنامج تلفزيوني معقمة وإذا لزم الأمر تخزينها على المدى الطويل عند أربع درجات مئوية. في هذه الدراسة يتم تصنيف عينات Astyanax الجنينية لتحليل التعبير الجيني عالي الجودة.
وقد تم تنفيذ هذه العملية بنجاح في كل من أسماك الباشون الكهفية وأجنة الأسماك السطحية. أجنة سمك الكهف المسمى للتعبير Sox9 إظهار وضع علامات واضحة في الأقواس الفرعية النامية والزعنفة الصدرية. لاحظ أن التلطيخ غائب تقريبا في كيس صفار أو somites النامية على الجناح.
وبالمثل، فإن تعبير Tfap2a واضح في أجزاء من الرأس النامية كخلايا قمة عصبية مبكرة للهجرة على طول منطقة الجناح الظهري للجنين. وينظر إلى الجين الثالث المقدمة لأجنة سمك الكهف، Phf20a، في أجزاء من mesoderm الجسدية والرأس الخلفي التي متجهة إلى أن تؤدي إلى الأنسجة العظمية. تظهر أجنة الأسماك السطحية التي تحمل علامة CXCR وضع علامات إيجابية في المناطق المعزولة من الرأس والجناح ، بالإضافة إلى عدد قليل من الخلايا الفردية التي تُحيط كيس الصفار.
يتم التعبير عن الجين Adcyap1a في مناطق الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك الخلايا النخامية. لاحظ التعبير الخاص للغاية في مجموعات ثنائية ثنائية من الخلايا على الجانب الظهري للجنين، بالإضافة إلى منطقة أكبر من التعبير المتوسط. الجين الأخير الذي تم فحصه لأجنة سمك الكهف ، Sox10 ، واضح كعلامة مبكرة لل قمة عصبية على الجانبين الأيسر والأيمين للجنين الظهري.
بعد الانتهاء في الموقع، ونحن عادة صورة نتائجنا باستخدام المجهر الخفيفة. من الأفضل القيام بذلك في غضون أسبوعين بعد الانتهاء من أجل تجنب تدهور تلطيخ.
