هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح بتحديد التعبير الجيني في يرقات سمك الحمار الوحشي القديمة والأحداث أثناء التحول. ميزة هذه التقنية هي أن العديد من الخطوات قد تم تحسينها لاختراق المسبار وتصور الكلى. للبدء، قم بإعداد سمك الحمار الوحشي البالغ للتزاوج عن طريق إضافة سمكة ذكر وسمكة واحدة في خزان تزاوج في وقت متأخر من بعد الظهر بعد وجبتهم الأخيرة.
في اليوم التالي، جمع الأجنة في لوحات بيتري التي تحتوي على E3 المتوسطة. خمسة أيام بعد الإخصاب، ضع شاشة 400 ميكرومتر في خزان سعة 2.8 لتر وملئه بسنتيمترين من مياه النظام. ثم أضف اليرقة من طبق بيتري واحد.
لإصلاح اليرقة ، قم بإزالة خزان يرقة في النقطة الزمنية المطلوبة ، ثم ، باستخدام شبكة ونقل ماصة مع قطع طرفها ، قم بنقل اليرقة إلى لوحة بيتري. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من 2٪ tricaine لشل حركة اليرقة. بعد الجمود، استبدل tricaine ب 20 ملليلتر من حل الإصلاح.
بعد 30 دقيقة ، قم بنقل اليرقة إلى أنبوب 50 ملليلتر يحتوي على 25 ملليلتر من محلول التثبيت الطازج. ثم، وضمان أن الغطاء ضيق، صخرة ببطء الأنبوب في أربع درجات مئوية لمدة يومين. في اليوم الثالث ، استبدل محلول التثبيت ب 20 ملليلتر من PBST ثم نقل اليرقة إلى لوحة بيتري.
لقياس اليرقة ، ضع لوحة بيتري فوق مسطرة مسطحة تحت مجهر تشريح ، ثم ، باستخدام مناور رمش ، قم بتحريك كل يرقة إلى المسطرة لقياس طولها الإجمالي. بعد قياس جميع اليرقات ، اجمع عدة يرقات ذات أطوال مماثلة على قارورة زجاجية واحدة سعة 5.5 ملليلتر مع PBST. للجفاف، استبدل الPBST في القارورة الزجاجية بأربعة ملليلترات من الميثانول بنسبة 100٪، ثم قم بتخزين القارورة عند ناقص 20 درجة مئوية لمدة يومين.
للإماهة، استبدل الميثانول بنسبة 100٪ بأربعة ملليلترات من الميثانول بنسبة 75٪ وحل PBST بنسبة 25٪، وهز القارورة لمدة خمس دقائق. ثم، استبدال الميثانول وPBST الحل مع أربعة ملليلتر من PBST الطازجة والصخور القارورة مرة أخرى لمدة 10 دقائق. بالنسبة لهضم Proteinase K ، استبدل PBST بمليلترين من محلول Proteinase K وهز القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
بعد ذلك ، للتبييض ، قم بنقل اليرقة إلى لوحة من ستة آبار واستبدال PBST بثلاثة ملليلترات من محلول التبييض الطازج. بعد الاختفاء الكامل للتصبغ على طول mesonephros ، قم بنقل اليرقة مرة أخرى إلى قارورة زجاجية ، واستبدل محلول التبييض بأربعة ملليلترات من PBST ، وهز القارورة لمدة 10 دقائق. قبل التهجين، استبدل حل التثبيت بأربعة ملليلترات من PBST وهز القارورة لمدة 10 دقائق، ثم استبدل PBST بأربعة ملليلترات من محلول Hyb والصخور لمدة 10 دقائق.
بعد احتضانين إضافيين في محلول Hyb، استبدل الحل بأربعة ملليلترات من محلول Hyb+. في وقت واحد تمييع مسبار الفلورسين EGFP 1-100 في 500 ميكرولتر من التهجين بالإضافة إلى الحل ، واحتضان القارورة والتحقيق في 70 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، لتهجين المسبار، استبدل محلول Hyb+في القارورة بالمسبار المحمى مسبقا واحتضنه عند 70 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، أضف 50 ملليلتر من SSCT مسخن 0.2 مرة في أنبوب 50 ملليلتر. ثم أدخل مصفاة خلايا سعة 100 ميكرومتر في الجزء العلوي من الأنبوب ، ونقل اليرقة من القارورة الزجاجية إلى مصفاة الخلية ، وضمان غمر اليرقة في العازلة ، واحتضان القارورة عند 70 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد الحضانة، نقل مصفاة الخلية إلى أنبوب جديد يحتوي على سخن 0.2 مرات SSCT، واحتضان مرة أخرى في 70 درجة مئوية لمدة ساعتين.
بعد ذلك ، لمنع ، نقل اليرقة إلى قارورة زجاجية جديدة والسماح لها بالتبريد لدرجة حرارة الغرفة. ثم استبدل حل SSCT 0.2 مرة بأربعة ملليلترات من محلول SSCT 67٪0.2 مرة وحل MABT بنسبة 33٪ وهز القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، استبدل حل SSCTT MABT بأربعة ملليلترات من MABT الطازجة ، واحتضان القارورة على الروك لمدة 10 دقائق.
ثم، استبدال MABT مع أربعة ملليلتر من حل حجب واحتضان أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، استبدل محلول الحجب بمحلول للأجسام المضادة واحتضنه عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة يومين. لغسل الأجسام المضادة ، قم بنقل اليرقة إلى أنبوب 50 ملليلتر ، ثم أضف 40 ملليلتر من PBST2 ، ووضع الأنبوب على جانبه للحضانة الليلية عند أربع درجات مئوية.
في اليوم 12، بعد نقل الحمم البركانية إلى لوحة من ست آبار، استبدل PBST2 بثلاثة ملليلترات من العازلة تلطيخ. بعد حضانة لمدة خمس دقائق على الروك، واستبدال العازلة تلطيخ مع ثلاثة ملليلتر من محلول تلطيخ. عندما يتم الوصول إلى كثافة التلطيخ المطلوبة ، استبدل محلول التلطيخ بثلاثة ملليلترات من محلول التوقف والصخور لمدة 30 دقيقة.
ثم، نقل اليرقة إلى قارورة زجاجية جديدة، واستبدال محلول وقف مع أربعة ملليلتر من محلول تحديد الطازجة، واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. للتصوير، استبدل حل التثبيت بأربعة ملليلترات من برنامج تلفزيوني جديد. بعد احتضان لمدة 10 دقائق على الروك ، نقل اليرقة إلى لوحة من ستة آبار ، ثم استبدال PBST بأربعة ملليلترات من PBST الطازجة والصخور لوحة مرة أخرى لمدة 10 دقائق.
بعد ذلك ، أضف ثلاثة ملليلترات من 50٪ من الجليسيرول في PBST والصخور لمدة 10 دقائق ، ثم ، باستخدام مجهر تشريح ، قم بتصوير اليرقة مباشرة في لوحة من ستة آبار. هذا في بروتوكول التهجين الموقعي التسميات على نحو فعال خلايا السلف الكلى ومختلف هياكل الكلية باستخدام تطوير mesonephros. تتشكل الكلية النسونيفية الأولية عند ظهرية 5.2 ملليمتر تقريبا إلى الفروس.
مجموعات من الخلايا السلف موجودة أثناء تطوير mesonephros بالإضافة إلى خلايا السلف واحد. في الأحداث الأكبر ، يمكن أن يحدث تلطيخ الخلفية في السخام. وعموما، يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة الأنسجة الأخرى التي تتشكل أثناء التحول، بالإضافة إلى تشريح أعضاء البالغين.
