يصف هذا البروتوكول نظام علم الوراثة العكسي الموثوق به والفعال لصنع الفيروسات الروتا المؤتلفة. كما يشرح كيفية جعل الفيروسات الروتا المؤتلفة التي تعبر عن البروتينات علامة الفلورسنت. هذه الطريقة بسيطة تتطلب الحد الأدنى من البلازميدات ويمكن أن تولد الفيروسات الروتا المؤتلفة التي تعبر عن بروتينات الفلور منفصلة وكذلك البروتينات الفيروسية.
تبدأ بذر خلايا BHKT7 على لوحات 12-جيدا. شطف أحادية التقاء حديثا من الخلايا مع برنامج تلفزيوني. ثم تعطيل أحادية مع حل تريبسين EDTA وإعادة تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من GMEM المتوسطة كاملة.
تحديد تركيز خلايا BHKT7 قابلة للحياة باستخدام تريبان الأزرق وعداد خلية الآلي. ثم البذور مرتين 10 إلى الخلايا الخامسة في ملليلتر واحد من GMEM في كل بئر من 12-جيدا خلية لوحة الثقافة. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، قم بإعداد خليط البلازميد لتحولات وفقاً لاتجاهات المخطوطات. ثم إضافة 110 ميكرولترات من ما قبل تدفئة انخفاض مصل المتوسطة إلى كل خليط البلازميد وماصات بلطف صعودا وهبوطا لخلط. إضافة 32 ميكرولترات من كاشف transfection إلى الخليط.
القيام طرد مركزي وجيزة بعد دوامة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. وفي الوقت نفسه، شطف خلايا BHKT7 مع ملليلتر اثنين من المتوسط GMEM غير مكتملة. إضافة ملليلتر واحد من SMEM المتوسطة غير مكتملة لكل بئر وإعادة لوحة إلى الحاضنة.
بعد الحضانة لمدة 20 دقيقة، واستخدام 200 الأنابيب ميكرولتر لإضافة الخليط transfection قطرة قطرة إلى كل بئر. صخرة بلطف لوحة وإعادته إلى الحاضنة. بعد يومين من عملية نقل الدم، شطف أحادية نقش حديثا من خلايا MA104 مع برنامج تلفزيوني.
تعطيل أحادية مع حل تريبسين-EDTA وإعادة ضغط الخلايا في خمسة ملليلتر من متوسطة كاملة DMEM. عد الخلايا وضبط التركيز إلى ثمانية مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من المتوسط DMEM غير مكتملة. إضافة 0.25 ملليلتر من خلايا MA104 قطرة إلى الآبار مع خلايا BHKT7 المصابة عبر.
ضبط تركيز التربسين إلى 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر عن طريق إضافة 0.8 ميكرولترات إلى واحد مليغرام لكل مليلتر حل الأسهم التربسين لكل بئر. تخفيف الخلايا MA104 المتبقية إلى تركيز 1.5 مرة 10 مرات إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر في DMEM كاملة متوسطة ووضع مليلترين في كل بئر من لوحة ستة جيدا. بعد ستة أيام من العدوى، استرداد الفيروس المؤتلف من الخلايا المصابة.
تخضع خلايا BHKT7 MA104 لثلاث دورات من التجميد/ الذوبان في ظروف معقمة ، مما ينقل اللوحات بين ثلاجة سالبة 20 درجة مئوية ودرجة حرارة الغرفة. نقل lysates إلى 1.5 ملليلتر أنابيب. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب لمدة 10 دقائق في 500 مرة ز وأربع درجات مئوية إلى بيليه الحطام الخلوي.
جمع المابير وتخزينها في أربع درجات مئوية. إضافة التربسين إلى 100 ميكرولترات من الخلايا أوضح lysate إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر واحتضان الخليط في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم إعداد سلسلة تخفيف المسلسل 10 أضعاف تتراوح من 10 إلى السلبية واحد إلى 10 إلى سبعة السلبية في المتوسط DMEM غير مكتملة.
شطف الطبقات الأحادية MA104 مرتين مع ملليلترين من برنامج تلفزيوني ومرة واحدة مع متوسطة DMEM غير مكتملة. إضافة 400 microliters من التخفيفات lysate في مكررة للوحات واحتضان لهم في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، هزاز كل 10 إلى 15 دقيقة لإعادة توزيع التخفيفات عبر monolayer. إعداد حل تراكب agarose MEM من خلال الجمع بين وحدات التخزين المتساوية من قبل 2X EMEM مع 1.5٪ ذاب وتبريد agarose.
الحفاظ على هذا الحل عند 42 درجة مئوية في حمام مائي وضبط تركيز التربسين إلى 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر على الفور قبل وضعه على الخلايا. التخفيفات من لوحة ستة بئر. ثم شطف الخلايا مرة واحدة مع مليلتر اثنين من المتوسطة غير مكتملة.
إضافة بلطف ثلاثة ملليلتر من حل تراكب agarose MEM على monolayer الخلية في كل بئر. السماح لأغاروز لتصلب في درجة حرارة الغرفة. ثم ارجع اللوحات إلى الحاضنة.
بعد ثلاثة أيام، قم بإعداد حل تراكب agarose MEM كما هو موضح سابقًا وأضف أحمرًا محايدًا إلى تركيز نهائي يبلغ 50 ميكروغرامًا لكل ملليلتر قبل الاستخدام مباشرةً. إضافة ملليلتر اثنين من حل تراكب على رأس agarose القائمة في لوحات ستة بئر. السماح agarose لتصلب والعودة لوحة إلى الحاضنة، والتأكد من حماية لوحات مع أحمر محايد من الضوء.
خلال الساعات الست القادمة، حدد لويحات فيروس الروتا بمساعدة صندوق ضوئي. استخدام ماصات نقل المتاح لاختيار لويحات محددة بوضوح، واستعادة المقابس agarose التي تمتد بالكامل إلى طبقة الخلية. طرد المكونات في أنبوب 1.5 ملليلتر يحتوي على 0.5 ملليلتر من متوسط DMEM غير مكتمل ودوامة العينة لمدة 30 ثانية.
تضخيم البلاك معزولة الفيروس مائل في المتوسطة عن طريق الانتشار على الطبقات الأحادية MA104 أو AT25 قارورة مع DMEM المتوسطة غير مكتملة و0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من التربسين. إضافة 600 microliters من lysates الخلايا المصابة وأوضح و 400 microliters من thiocyanate guanidinium في 1.5 ملليلتر microcentrifuge أنابيب. دوامة لهم لمدة 30 ثانية واحتضان لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
ثم إضافة 200 ميكرولترات من الكلوروفورم. دوامة الحل لمدة 30 ثانية واحتضانه لمدة ثلاث دقائق. بعد خمس دقائق microcentugugation في 13،000 مرات ز وأربع درجات مئوية، ونقل 550 ميكرولترات من المرحلة مائي العليا إلى أنبوب جديد.
إضافة مجلدين من الكحول isopropyl الباردة وعكس الأنبوب أربع إلى ست مرات. احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 13،000 مرات ز وأربع درجات مئوية.
تجاهل الماوس ترك بيليه الجيش الملكي النيبالي. غسل RNA بإضافة ملليلتر واحد من 75٪ الإيثانول إلى أنبوب عكس مرة واحدة وsuguging عليه لمدة خمس دقائق في 7، 500 مرات ز وأربع درجات مئوية. بعد إزالة بعناية الإيثانول، والسماح للرنا للهواء الجاف لمدة خمس إلى 10 دقائق.
ثم حل بيليه في 15 ميكرولترات من المياه الحرة النوى. إضافة اثنين microliters من 6X الحمض النووي تحميل العازلة إلى 10 ميكرولترات من عينة الحمض النووي الريبي المذاب. تحميل على ما قبل الزهر 10٪ polyacrylamide هلام صغير.
حل RNAs بواسطة الكهرباء في tris-جليكاين تشغيل العازلة لمدة ساعتين تحت ثابت 16 مللي أمبير الحالية. بمجرد اكتمال تشغيل الجل ، نقع الجل لمدة خمس إلى 10 دقائق في الماء الذي يحتوي على ميكروغرام واحد لكل بروميد الإتهيديوم المليمتر والكشف عن شرائح الجينوم فيروس الروتا مع الترانرانيوم UV. وقد استخدم هذا البروتوكول الجيني لتوليد الفيروسات SA11 المؤتلفة التي يمكن التعرف عليها بسهولة مع فحص البلاك على خلايا MA104 السماح لعزل البلاك.
تم استخراج جينوم DSRNA من نوع rSA11 البرية المنقاة من البلاك وفيروسات SA11-UnaG بمحلول يحتوي على الفينول و thiocyanate guanidinium ، وحلته الكهرباء على هلام بولياكريلاميد 10 ٪ واكتشفت عن طريق تلطيخ مع بروميد الإتيهيديوم. كما هو متوقع، هاجر الجزء السابع أو NSP3 dsRNA من rSA11-UnaG أبطأ بكثير من ذلك من نوع rSA11 البرية بسبب وجود تسلسلات 2A-3xFLUnaG. للتحقق من التعبير عن بروتين الفلورسنت UnaG ، تم إصابة خلايا MA104 بنوع البرية وفيروس إعادة الكومبينات وفحصها باستخدام صورة حية لخلية.
وأظهر التحليل أن rSA11-UnaG أنتجت الفلورس الخضراء في حين لم يتم الكشف عن الفلورسين في الخلايا المصابة بنوع rSA11 البري. تم إجراء تحليل مناعي للتحقيق فيما إذا كان العنصر 2A من rSA11-NSP3-2A-xflUnaG روج للتعبير عن بروتينين منفصلين. وأظهر التحليل أن NSP3-2A و 3xFL-UnaG تم التعبير عنها بالفعل كبروتينات منفصلة تشير إلى عنصر وظيفي 2A.
للشفاء الناجح لفيروس الروتا المؤتلف، فمن الأهمية بمكان استخدام الجودة، وصيانة جيدة BHKT7 الخلايا لTransfection وخلايا MA104 لأكثر من البذر، فضلا عن كميات دقيقة من البلازميدات نقية للغاية. على الرغم من أن هذا البروتوكول يشرح كيفية استخدام نظام الوراثة العكسي لتعديل جين فيروس الروتا NSP3 ، يمكن استخدام نفس النهج لتعديل الجينات الأخرى مثل SP1.
