该协议描述了一个可靠和有效的反向遗传学系统，用于制造重组轮状病毒。它还解释了如何制造表达荧光标记蛋白的重组轮状病毒。这种方法简单，需要最少的质粒，并可以产生重组轮状病毒，表达单独的氟蛋白和病毒蛋白。
首先将BHKT7细胞播种到12孔板上。用 PBS 冲洗新鲜汇合的单层细胞。然后用 trypsin-EDTA 溶液破坏单层，并在五毫升的 GMEM 完整介质中重新发送细胞。
使用 trypan 蓝色和自动细胞计数器确定可行 BHKT7 细胞的浓度。然后在一毫升GEM中将两次10至第五细胞播种到12井细胞培养板的每个井中。在5%的二氧化碳孵化器中孵育37摄氏度的板。
第二天，根据手稿指示准备质粒混合物进行转染。然后将110微升预加热的减少血清介质添加到每个质粒混合物中，然后轻轻上下移液器混合。在混合物中加入32微升转染试剂。
在涡旋后进行短暂的离心，并在室温下孵育20分钟。同时，用两毫升的GMEM不完全介质冲洗BHKT7细胞。在每个井中加入一毫升的SMEM不完整介质，并将板返回孵化器。
经过20分钟的孵育，使用200微升移液器将转染混合物一滴地添加到每一个井中。轻轻摇动板，并返回到孵化器。转染两天后，用PBS冲洗MA104细胞的新鲜汇合单层。
用 trypsin-EDTA 溶液破坏单层，并在 DMEM 完整介质的五毫升中重新发送细胞。计算细胞数，将浓度调整为每毫升DMEM不完全介质的8倍10至第五细胞。用转染的BHKT7细胞滴滴加入0.25毫升MA104细胞的井中。
通过将0.8微升至每毫升1毫克的 trypsin 库存溶液添加到每井，将 trypsin 浓度调整为每毫升 0.5 微克。在DMEM完整介质中，将剩余的MA104细胞稀释至每毫升10至第五个细胞的浓度，并在六井板的每个井中放置两毫升。转染六天后，从转染细胞中恢复重组病毒。
在无菌条件下，BHKT7 MA104细胞接受三个循环的冻结/解冻，在负20摄氏度的冰柜和室温之间移动板。将酸盐转移到1.5毫升管中。在500倍g和4摄氏度下将管子离心10分钟，以产生细胞碎片。
收集上一杯，并储存在四摄氏度。将 trypsin 加入到 100 微升澄清细胞中，最终浓度为每毫升 10 微克，并在 37 摄氏度下孵育混合物一小时。然后准备一个10倍的序列稀释系列，范围从10到负1到10到负7在DMEM不完整介质。
用两毫升 PBS 冲洗 MA104 单层两次，使用 DMEM 不完整介质冲洗一次。将400微升的酸盐稀释剂重复添加到板中，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育，每10至15分钟摇动一次，将稀释液重新分配给单层。通过将等量预热 2X EMEM 与 1.5% 熔化和冷却的 agarose MEM 覆盖解决方案相结合，准备 agarose MEM 覆盖解决方案。
在水浴中将溶液保持在 42 摄氏度，并在将其放置在细胞上之前立即将 trypsin 浓度调整为每毫升 0.5 微克。从六井板中吸出酸化稀释剂。然后用两毫升不完全介质冲洗细胞一次。
轻轻地将三毫升的 agarose MEM 覆盖溶液添加到每个井中的细胞单层上。让加糖在室温下变硬。然后将盘子返回孵化器。
三天后，准备一个如前面描述的红糖 MEM 覆盖溶液，并在使用前将中性红添加到每毫升 50 微克的最终浓度中。在六孔板的现有加糖上添加两毫升的覆盖溶液。让加糖硬化，将板返回培养箱，确保保护带中性红的板免受光。
在接下来的六个小时里，用灯箱识别轮状病毒斑块。使用一次性转移移液器挑选明确定义的斑块，恢复完全延伸到细胞层的气糖塞。将插头排出含有 0.5 毫升 DMEM 不完整介质的 1.5 毫升管中，并旋转样品 30 秒。
通过在MA104单层或 AT25 烧瓶上传播，通过 DMEM 不完全介质和每毫升 trypsin 0.5 微克传播，将分离的病毒斑子病毒稀释到介质中。将600微升澄清的受感染细胞立糖酸盐和400微升的硫化铀加入1.5毫升微离心管。旋转它们30秒，在室温下孵育5分钟。
然后加入200微升氯仿。旋转溶液30秒，孵育3分钟。在13，000倍的g和4摄氏度的5分钟微离心后，将550微升上水相转移到一个新鲜管中。
加入两卷冷异丙醇，将管子倒置四到六次。在室温下孵育样品10分钟。然后在13，000倍的g和4摄氏度下离心10分钟。
丢弃上一液离开RNA颗粒。将一毫升75%乙醇加入管中，将RNA倒置一次，并在7，500倍的g和4摄氏度下离心5分钟，清洗RNA。小心去除乙醇后，让RNA风干5至10分钟。
然后将颗粒溶解在15微升无核酸酶水中。在溶解RNA样品的10微升中加入两个6XDNA加载缓冲液的微升。将它加载到预铸造 10%聚丙烯酰胺迷你凝胶上。
在恒定的16毫安电流下，通过三丝甘油运行缓冲液中的电泳解决RNA，持续两个小时。一旦凝胶运行完成，将凝胶浸泡在含有每毫升溴化乙基一微克的水中 5 至 10 分钟，然后用紫外线转光器检测轮状病毒基因组片段。这种反向遗传学协议用于生成重组SA11病毒，这些病毒可以通过MA104细胞上的斑块测定轻松识别，从而允许斑块分离。
斑块纯化rsA11野生型和SA11-UnaG病毒的dsRNA基因组提取了含有苯酚和硫化硅酸的硫化铀溶液，通过电泳在10%聚丙烯酰胺凝胶上解析，并通过溴化乙酰胺染色检测。正如预期的那样，由于存在2A-3xFLUnaG序列，rSA11-UnaG的第七段或NSP3 dsRNA迁移速度比rSA11野生类型慢得多。为了检查UnaG荧光蛋白的表达，MA104细胞感染了野生型和重组病毒，并用活细胞成像器检查。
分析表明，rSA11-UnaG产生绿色荧光，而在感染rSA11野生型细胞中未检测到荧光。进行免疫blot分析，以调查rsA11-NSP3-2A-xflUnaG的2A元素是否促进两种独立蛋白质的表达。分析表明，NSP3-2A和3xFL-UnaG确实被表达为单独的蛋白质，表明一个功能2A元素。
要成功回收重组轮状病毒，关键是使用优质、维护良好的BHKT7细胞进行转染和MA104细胞进行过度播种以及精确量高纯质粒。虽然该协议解释了如何使用反向遗传学系统来修改轮状病毒NSP3基因，但同样的方法可以用来修改其他基因，如SP1。
