Этот протокол описывает надежную и эффективную систему обратной генетики для изготовления рекомбинантных ротавирусов. Он также объясняет, как сделать рекомбинантные ротавирусы, которые выражают флуоресцентные белки маркера. Этот метод прост, требующих минимального количества плазмидов и может генерировать рекомбинантные ротавирусы, которые выражают отдельные белки фтора, а также вирусные белки.
Начните с посева клеток BHKT7 на 12-колодец пластин. Промыть свежетекученый монослой клеток с помощью PBS. Затем нарушить монослой с трипсином-EDTA решение и повторного перерасхода клеток в пять миллилитров GMEM полной среде.
Определите концентрацию жизнеспособных ячеек BHKT7 с помощью trypan blue и автоматизированного счетчика ячеек. Затем семена два раза от 10 до пятой клетки в один миллилитр ГМЭМ в каждый колодец 12-хорошо пластины клеточной культуры. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе двуокиси углерода 5%на ночь.
На следующий день приготовьте плазмидную смесь для трансфекции в соответствии с рукописными указаниями. Затем добавьте 110 микролитров предварительно разогретой среды сыворотки к каждой плазмидной смеси и аккуратно пипетку вверх и вниз, чтобы перемешать. Добавьте в смесь 32 микролитров трансфектного реагента.
Сделайте краткую центрифугу после вихря и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут. Между тем, промыть клетки BHKT7 с двумя миллилитров GMEM неполной среде. Добавьте один миллилитр неполной среды SMEM к каждой пластине и верните пластину в инкубатор.
После 20-минутной инкубации используйте 200 микролитровый пипеттор, чтобы добавить трансфекцию смеси капля за каплей к каждой хорошо. Аккуратно раскачивайте тарелку и возвращайте ее в инкубатор. Через два дня после трансфекции, промыть свежестекательный монослой клеток MA104 с PBS.
Нарушить монослой с трипсином-EDTA решение и повторного перерасхода клеток в пяти миллилитров DMEM полной среде. Подсчитайте клетки и отрегулируйте концентрацию до 8 времен 10 к пятым клеткам в миллилитр DMEM неполная среда. Добавьте 0,25 миллилитров клеток MA104 в скважины с трансфицированными клетками BHKT7.
Отрегулируйте концентрацию трипсина до 0,5 микрограмма на миллилитр, добавив 0,8 микролитров к одному миллиграмму на миллилитр трипсиного раствора для каждой хорошо. Разбавить оставшиеся клетки MA104 до концентрации 1,5 раза от 10 до пятой клетки на миллилитр в DMEM полной среде и место два миллилитров в каждом хорошо из шести хорошо пластины. Через шесть дней после трансфекции, восстановить рекомбинантный вирус из трансфицированных клеток.
Подвергньте клетки BHKT7 MA104 трем циклам замораживания/оттепели в стерильных условиях, перемещая пластины между отрицательной морозильной камерой 20 градусов по Цельсию и комнатной температурой. Передача лисаторов в 1,5 миллилитровые трубки. Центрифуга труб в течение 10 минут при 500 раз g и 4 градуса по Цельсию, чтобы гранулировать клеточный мусор.
Соберите супернатант и храните его при четырех градусах по Цельсию. Добавьте трипсин в 100 микролитров очищенной клетки лизайте до конечной концентрации 10 микрограмм на миллилитр и инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. Затем подготовьте 10-кратную серийную серию разбавления от 10 до отрицательной до отрицательной семерки в неполной среде DMEM.
Промыть MA104 монослой дважды с двумя миллилитров PBS и один раз с DMEM неполной среде. Добавьте 400 микролитров лизатных разбавлений в дубликате к пластинам и инкубируйте их при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе, качая каждые 10-15 минут, чтобы перераспределить разбавления по монослойу. Приготовьте решение для наложения агарозы MEM, объединив равные объемы предварительно разогретой 2X EMEM с 1,5%расплавленной и охлажденой агарозой.
Поддерживайте этот раствор при 42 градусах Цельсия на водяной бане и отрегулируйте концентрацию трипсина до 0,5 микрограмма на миллилитр непосредственно перед тем, как поместить его на клетки. Аспирировать лисад разбавления из шести хорошо пластины. Затем промыть клетки один раз с двумя миллилитров неполной среды.
Аккуратно добавьте три миллилитров раствора наложения агарозы MEM на монослой клетки в каждом хорошо. Разрешить агарозы затвердеть при комнатной температуре. Затем верните пластины в инкубатор.
Три дня спустя, подготовить решение агарозы MEM наложения, как описано ранее, и добавить нейтральный красный до окончательной концентрации 50 микрограмм на миллилитр непосредственно перед использованием. Добавьте два миллилитров наложения раствора поверх существующей агарозы в шести-хорошо пластин. Разрешить агарозы затвердеть и вернуть пластину в инкубатор, убедившись, чтобы защитить пластины с нейтральным красным от света.
В течение следующих шести часов, определить ротавирусные бляшки с помощью световой коробки. Используйте одноразовые пипетки для выбора четко определенных бляшек, восстанавливая пробки агарозы, которые полностью распространяются на слой клетки. Изгнать вилку в 1,5 миллилитровую трубку, содержащую 0,5 миллилитров DMEM неполной среды и вихрем образца в течение 30 секунд.
Усилить налет изолированный вирус eluted в среду путем распространения на MA104 монослой или AT25 колбы с DMEM неполной среде и 0,5 микрограмм на миллилитр трипсина. Добавьте 600 микролитров очищенного лизата инфицированных клеток и 400 микролитров тиоцианата гуанидиния в 1,5 миллилитровые микроцентрифуговые трубки. Вихрь их в течение 30 секунд и инкубировать их при комнатной температуре в течение пяти минут.
Затем добавьте 200 микролитров хлороформа. Вихрь раствор в течение 30 секунд и инкубировать его в течение трех минут. После пятиминутной микроцентрифугации при 13 000 г и 4 градусах Цельсия перенесите 550 микролитров верхней фазы в свежую трубку.
Добавьте два тома холодного изопропилового спирта и инвертировать трубку четыре-шесть раз. Инкубировать образец при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем центрифуга его в течение 10 минут при 13000 раз г и четыре градуса по Цельсию.
Отбросьте супернатант, оставляя гранулы РНК. Вымойте РНК, добавив один миллилитр 75%этанола в трубку инвертирования его один раз и центрифугирования его в течение пяти минут при 7500 раз г и четыре градуса по Цельсию. После тщательного удаления этанола, дайте РНК высохнуть в течение пяти-десяти минут.
Затем растворите гранулы в 15 микролитров нуклеазы свободной воды. Добавьте два микролитров буфера загрузки 6X ДНК в 10 микролитров растворенного образца РНК. Загрузите его на предварительно отлитый 10%полиакриламид мини-гель.
Разрешить РНК с помощью электрофорез в трис-глицин работает буфер в течение двух часов под постоянным 16 миллиампер тока. После того, как гель перспективе завершена, замочить гель в течение пяти до 10 минут в воде, содержащей один микрограмм на миллилитр бромистого этидия и обнаружить сегменты генома ротавируса с УФ-трансилюминатором. Этот протокол обратной генетики был использован для генерации рекомбинантных вирусов SA11, которые могут быть легко идентифицированы с анализом бляшек на клетках MA104, что позволяет изоляции бляшек.
Геномы dsRNA очищенного rSA11 дикого типа и вирусов SA11-UnaG были извлечены с раствором, содержащим фенол и гуанидиний тиоцианат, решены электрофорезом на 10%полякриламидном геле и обнаружены путем окрашивания бромистого этидия. Как и ожидалось, сегмент 7 или NSP3 dsRNA rSA11-UnaG мигрировали гораздо медленнее, чем у дикого типа rSA11 из-за наличия последовательностей 2A-3xFLUnaG. Чтобы проверить экспрессию флуоресцентного белка UnaG, клетки MA104 были заражены диким типом и рекомбинантным вирусом и исследованы с помощью живого клеточного изображения.
Анализ показал, что rSA11-UnaG производит зеленую флуоресценцию, в то время как флуоресценция не была обнаружена в клетках, инфицированных диким типом rSA11. Иммуноблотный анализ был проведен для изучения того, способствовал ли элемент 2A rSA11-NSP3-2A-xflUnaG выражению двух отдельных белков. Анализ показал, что NSP3-2A и 3xFL-UnaG действительно были выражены как отдельные белки, указывающие на функциональный элемент 2A.
Для успешного восстановления рекомбинантного ротавируса крайне важно использовать качественные, хорошо обслуживаемые клетки BHKT7 для трансфекции и клетки MA104 для более посева, а также точное количество высокомеченой плазмиды. Хотя этот протокол объясняет, как использовать обратную генетическую систему для изменения гена ротавируса NSP3, тот же подход может быть использован для изменения других генов, таких как SP1.
