يستخدم هذا النموذج الصوتي البشري الفردي الخلايا المناعية ذات الصلة كأداة قوية للتنبؤ بالاستجابة المناعية الحادة للمواد بما في ذلك المواد النانوية وعقاقير المعرفة. هذه الطبية يجمع بين الخلايا الظهارية البشرية والخلايا المناعية الأولية الإنسان لتقييم تلك التفاعلات المحددة. يوفر استخدام أحاديات الخلايا المتجمدة الطازجة والمجمدة مرونة لخطة التجربة.
وقد أظهرت العديد من الدراسات أن هذا النموذج يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في الاتصال بين النجوم بين حس السلوك والحس المناعي. كما يتضمن هذا العرض كل التفاصيل الهامة ل studing نموذج سمة شخصية في ثقافة الخلية، والتعليمات البصرية لتكرار التجارب. تعد عدة خطوات في بروتوكول المثانة معقدة وتتطلب معالجة خاصة.
لذلك يتم إظهارها مع جميع التفاصيل المطلوبة التي يمكن متابعتها بسهولة. لعزل أحاديات الدم الطرفية من المعاطف بافي الإنسان، وتقسيم حصاة الخبز معطف محتويات حقيبة، بالتساوي بين 250 ملليلتر أنابيب المخروطية. جلب بعناية الحجم الكلي في كل أنبوب 250 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني وخلط الأنابيب مع ثلاثة انقلابات لطيف.
ثم تقسيم حل برنامج تلفزيوني معطف بافي بالتساوي بين أربعة أنابيب 50 ملليلتر جديدة، ثم إضافة 10 ميكرولتر من CD 14 حبات مغناطيسية إيجابية الخلايا الإجمالية السابعة إلى الأنبوب وخلط جيدا عن طريق الأنابيب. عند الملء، قم بفصل الماصات عن ttertter وقم على الفور بتوصيل الفتحة العليا للميصة بإبهام ثم وضع الماصات المملوءة في الجزء السفلي من أنبوب واحد وافصل فتحة الماصات للسماح للتدرج المتوسط الكثافة للتدفق ببطء تحت خليط PBS معطف بافي، حتى يتم ترك ملليلتر واحد من متوسطة الانحدار الكثافة داخل الماصة. عندما تم إضافة متوسط التدرج الكثافة إلى كل أنبوب في نفس الطريقة فصل الخلايا بواسطة الطرد المركزي التدرج الكثافة واستخدام ماصة المصلية لجمع أبيض سميكة من اثنين إلى ثلاثة ملليمترات طبقة خلية أحادية النوية الدموية الطرفية من بين البلازما والطبقات المتوسطة التدرج الكثافة.
أفضل طريقة لتوصيل الطبقة هي إزالة البلازما أولاً ثم تقوم بقمع ماصاتنا المنطقية لجمع الخلايا. سحب خلايا أحادية النوى الدم الطرفية من كل مجموعة من أنبوبين في أنبوب واحد جديد 50 ملليلتر وغسل الخلايا مرتين مع حجم إجمالي 50 ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد في غسل. ثم تجاهل supernatant و resuspend الماص في كل في خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد وتجمع تعليق الخلية في أنبوب واحد للعد.
بعد عد, الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى وإعادة تعليق بيليت إلى 80 ملليلتر من العازلة الفاصل المغناطيسي لكل حضور الخلايا السابعة. ثم إضافة 10 ميكروليترس من CD 14 حبات مغناطيسية إيجابية في حضور الخلايا الإجمالية السابعة إلى الأنبوب وخلط جيدا عن طريق pipetting. بعد حضانة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية شطف عمود مغناطيسي مع ثلاثة ملليلتر من العازلة الفاصل المغناطيسي وإضافة الخلايا إلى العمود.
اغسل العمود ثلاث مرات مع ثلاثة ملليلتر من وحدات التخزين المؤقت لكل غسل ونقل العمود إلى أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من عازلة فصل مغناطيسية جديدة. ثم استخدام المكبس وخمسة ملليلتر من العازلة لطرد CD 14 الخلايا الإيجابية في أنبوب. لا تحث على التمايز من حبة المغناطيسي المعزولة CD 14 الخلايا الإيجابية.
أولاً، إعادة تعليق الخلايا في مرة واحدة حضور إلى الخلايا الستة لكل ملليلتر تركيز في خلية ثقافة المتوسطة. أو MDDC التمايز، إضافة 10 نانوغرام لكل ملليلتر من ومن حبيبات الموقع عامل تحفيز مستعمرة الضامة إلى الأنبوب وإضافة ثلاثة ملليلتر من الخلايا إلى كل بئر من ستة صحن خلية جيدة لوحة، أو التمايز MDM إضافة 10 نانوغرام لكل ملليلتر من عامل تحفيز مستعمرة الضامة إلى الخلايا وطبق الخلايا كما أظهرت للتو. لإعداد خلية ظهارية بشرية السنخية الخلية ثلاثية الخلية نموذج الثقافة المشتركة، نقل أول 1.5 ملليلتر من قبل الدافئة خلية ثقافة المتوسطة في العدد المناسب من الآبار من لوحة 12 جيدا ووضع ثقافة الخلية إدراج في كل بئر.
أضف التالي 500 ميكرولترات من تعليق الخلايا الظهارية بكثافة خمس مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر في الجانب apical من كل إدراج وتغطية لوحة لاحتضان لمدة أربعة أيام في حاضنة ثقافة الخلية. أو بذر MDDC يستبدل supernatant من الآبار من ستة لوحات الآبار المستخدمة لتمايز MDDC، مع ملليلتر واحد من خلية جديدة متوسطة ثقافة دافئة واستخدام مكشطة الخلية لفصل الخلايا الالتزام من كل بئر. غسل كل بئر ثلاث مرات مع supernate وفي كل بئر والجمع بين كل من حلول الخلية في أنبوب واحد الطرد المركزي.
وMDDC حصادها عن طريق الطرد المركزي والملاقط المعقمة لوضع إدراج من 12 لوحات البئر رأسا على عقب في طبق بيتري العقيمة. كشط أي خلايا ظهارية من الجانب القاعدي من إدراج وإعادة تعليق MDDCs في متوسطة زراعة الخلايا الطازجة القيام تركيز 4.2 مرات 10 من هذه الخلايا لكل ملليلتر. ثم إضافة 150 ميكرولترات من الخلايا على كل إدراج بحيث يتم تغطية كامل سطح القاعدية من إدراج بالتساوي مع السائل دون فقاعات.
بالنسبة لبذر MDDM بعد حصاد MDDMs المتمايزة كما هو موضح لـ MDDCs ، قم بتخفيف الخلايا إلى 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الأربع لكل ملليلتر من تركيز متوسط لثقافة الخلايا الطازجة وإضافة 500 ميكرولترات من الخلايا أسفل جدار كل خلية ظهارية وMDDC تحتوي على إدراج ثقافة الخلية ، ثم ضع الغطاء على اللوحة ووضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلايا لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي الطامح من كل من المناطق apical وbaal كل خلية ثقافة إدراج وآبار. ثم تقوم بتعقيم الملاقط لرفع إدراج من الآبار وإضافة 600 ميكرولترات من ما قبل الوارزم الطازجة إلى خلية ثقافة المتوسطة لكل بئر.
بعد ستة أيام من التمايز، تظهر MDMs مستديرة الشكل بينما تشكل MDDCs مجموعات تتكون من خلايا ذات شكل أكثر ممدودًا ونتوءات قابلة للملاحظة. بعد ثلاثة أيام من النمو على إدراج الغشاء، والخلايا الظهارية تشكل زيادة كبيرة في إطلاق لاكتات ديهيدروجيناز ويلاحظ في المتوسطة ثقافة الخلية من المقصورة القاعدية عند التعرض لمراقبة إيجابية لتمزق الغشاء، مما يثبت استجابة النموذج لمادة السامة للخلايا. لا زيادة في الافراج عن dehydrogenase اللاكتات كما يقاس على التحفيز apical مع TNF ألفا أو LPS.
ولوحظت زيادات هامة إحصائيا في إطلاق IL6 و IL8 في كل من LPS و TNF ألفا العينات المعالجة مقارنة مع السيطرة على الخلايا غير المعالجة. لا توجد اختلافات في مورفولوجيا الخلية لوحظت بين نماذج الثقافة المشتركة باستخدام MDDMs و MDDCs من أحاديات الدم المحيطية الطازجة مقارنة بتلك التي تستخدم الخلايا المذابة في LPS و TNF ألفا تتعرض الثقافة المشتركة ، لوحظت طبقة ظهارية معطلة. فمن الممكن استخدام أنواع أخرى من الخلايا البشرية مثل مجرى الهواء أو الخلايا القصبية، ويمكن أيضا أن يتم تحليل نقاط نهاية أخرى.
وقد استلهم الباحثون أساسا من هذه التقنية باستخدام مماثلة لإعداد ولكن مع أنواع مختلفة من الخلايا.
