Este modelo de áudio humano individual usa células imunes relevantes como uma ferramenta poderosa para prever a resposta imune aguda de substâncias, incluindo nanomateriais e drogas de conhecimento. Estes médicos combinam células epiteliais humanas e células imunes primárias humanas para avaliar essas reações específicas. O uso de monócitos frescos e congelados proporciona flexibilidade para o plano de experimentos.
Inúmeros estudos têm demonstrado que esse modelo pode fornecer uma visão da comunicação interestelar entre um sentido comportamental e o senso imunológico. Como esta demonstração inclui todos os detalhes importantes para cravar o modelo um traço pessoal na cultura celular, instruções visuais para replicar experimentos. Várias etapas no protocolo da bexiga são complexas e requerem manuseio especial.
Portanto, eles são demonstrados com todos os detalhes necessários que eles podem ser facilmente seguidos. Para o isolamento de monócitos sanguíneos periféricos de casacos buffy humanos, divida o conteúdo do saco de casaco buffy da colheita, uniformemente entre tubos cônicos de 250 mililitros. Leve cuidadosamente o volume total em cada tubo 250 mililitros com PBS e misture os tubos com três inversões suaves.
Em seguida, divida a solução DEMELhador de casacos Buffy igualmente entre quatro novos tubos de 50 mililitros, em seguida, adicione 10 microliters de CD 14 contas magnéticas positivas as sétimas células totais ao tubo e misture bem por pipetação. Após o enchimento, retire a pipeta da pipeta e conecte imediatamente a abertura superior da pipeta com um polegar, em seguida, coloque a pipeta preenchida na parte inferior de um tubo e desligue a abertura da pipeta para permitir que o gradiente de densidade flua lentamente sob a mistura de pbs de casaco buffy, até que um mililitro do meio de gradiente de densidade seja deixado dentro da pipeta. Quando o meio gradiente de densidade tiver sido adicionado a cada tubo da mesma forma, separe as células por centrifugação de gradiente de densidade e use uma pipeta sorológica para coletar a camada branca de dois a três milímetros de espessura do sangue mononuclear de espessura entre o plasma e as camadas médias gradientes de densidade.
A melhor maneira de conectar a camada é remover o plasma primeiro e então você suprimir nossas pipetas lógicas para coletar as células. Puxe as células mononucleares de sangue periféricos de cada conjunto de dois tubos em um novo tubo de 50 mililitros e lave as células duas vezes com um volume total de 50 mililitros de PBS fresco por lavagem. Em seguida, descarte o supernaspe e resuspenque a pipeta em cada um em cinco mililitros de PBS fresco e acumule as suspensões celulares em um único tubo para contar.
Após a contagem, centrifugar as células novamente e resuspensar a pelette para 80 mililitros de tampão de separação magnética por atender às sétimas células. Em seguida, adicione 10 microliters de CD 14 contas magnéticas positivas por atender as sétimas células totais ao tubo e misturar bem por pipetação. Após uma incubação de 15 minutos a quatro graus Celsius enxágue uma coluna magnética com três mililitros de tampão de separação magnética e adicione as células à coluna.
Lave a coluna três vezes com três volumes mililitros de tampão por lavagem e transfira a coluna para um tubo de 15 mililitros contendo um mililitro de tampão de separação magnética fresco. Em seguida, use o êmbolo e cinco mililitros de tampão para colocar o CD 14 células positivas no tubo. Induzir diferenciação das contas magnéticas isoladas CD 14 células positivas.
Primeiro, resuspensar as células de uma só vez atender às seis células por mililitro concentração no meio da cultura celular. Ou diferenciação de MDDC, adicione 10 nanogramas por mililitro de e de colônia de macrófagos do local de granula ao tubo e adicione três mililitros de células a cada poço de uma placa de cultura celular de seis poços, ou a diferenciação de MDM adicione 10 nanogramas por mililitro de fator estimulante da colônia macrófago às células e emplaque as células como apenas demonstrado. Para configurar um tecido epitelial alveolar de tecido triplo celular modelo de co-cultura, primeiro transfira 1,5 mililitros de cultura celular pré-quente para o número apropriado de Poços de uma placa de 12 poços e coloque uma cultura celular inserida em cada poço.
Em seguida, adicione 500 microliters de suspensão celular epitelial a uma densidade de cinco vezes 10 às quintas células por mililitro no lado apical de cada inserção e cubra a placa para uma incubação de quatro dias na incubadora de cultura celular. Ou a semeadura MDDC substitui o supernascido dos Poços de seis placas de poços usados para diferenciação de MDDC, com um mililitro de meio de cultura celular quente fresco e usar um raspador de células para separar as células de adesão de cada poço. Lave cada poço três vezes com o supernato e em cada poço e combine todas as soluções celulares em um único tubo de centrífuga.
O MDDC colhido por centrifugação e pinças estéreis para colocar as pastilhas das 12 placas de poço de cabeça para baixo em uma placa de Petri estéril. Raspe quaisquer células epiteliais do lado basal da inserção e resuspenque os MDDCs em meio de cultura celular fresca faça uma concentração de 4,2 vezes 10 dessas células por mililitro. Em seguida, adicione 150 microliters de células em cada inserção para que toda a superfície basal da inserção seja igualmente coberta com o líquido sem bolhas.
Para a semeadura de MDDM após a colheita dos MDDMs diferenciados, como demonstrado para os MDDCs, diluir as células para um 2,5 vezes 10 para as quatro células por mililitro de concentração média de cultura celular fresca e adicionar 500 microliters de células abaixo da parede de cada célula epitelial e MDDC contendo inserção de cultura celular, em seguida, colocar a tampa sobre a placa e colocar a placa em uma incubadora de cultura celular por 24 horas. No dia seguinte, aspire o supernaente das áreas apical e basal de cada inserção de cultura celular e Wells. Em seguida, você esteriliza pinças para levantar as pastilhas dos Poços e adicionar 600 microliters de pré-aquecimento fresco ao meio de cultura celular para cada poço.
Após seis dias de diferenciação, os MDMs aparecem em forma redonda, enquanto os MDDCs formam aglomerados compostos por células com uma forma mais alongada e saliências observáveis. Após três dias de crescimento nas pastilhas de membrana, as células epiteliais formam um denso Um aumento significativo na liberação de lactato desidrogenase é observado no meio de cultura celular do compartimento basal após a exposição a um controle positivo para ruptura da membrana, provando a capacidade de resposta do modelo a uma substância citotóxica. Nenhum aumento na liberação de lactato dehidrogênioase medida sobre estimulação apical com TNF alfa ou LPS.
Aumentos estatisticamente significativos na liberação de IL6 e IL8 são observados em amostras tratadas alfa LPS e TNF em comparação com o controle de células não tratadas. Não são observadas diferenças na morfologia celular entre os modelos de co-cultura usando MDDMs e MDDCs de monócitos de sangue periféricos frescos em comparação com aqueles que usam células descongeladas em LPS e TNF alfa exposto co-cultura, observou-se uma camada epitelial interrompida. É possível usar outros tipos de células humanas, como as vias aéreas ou células bronquiolares, outros pontos finais também podem ser analisados.
Principalmente os pesquisadores foram inspirados por essa técnica usando uma configuração semelhante, mas com diferentes tipos de células.
