تم تمويل هذا العمل من قبل مختبر لورانس ليفرمور الوطني LDRD 18-ERD-062 (إلى CR). شكرا لجون موشلر على هديته الكريمة من خلايا DgKO و DgKI. شكرا للموظفين في مختبر المجهر الإلكتروني بجامعة كاليفورنيا بيركلي على المشورة والمساعدة في إعداد عينات المجهر الإلكتروني وجمع البيانات.

1. ذوبان الجليد والقسمة laminin-111
ملاحظة: يتوفر اللامينين 111 المنقى تجاريا (عادة ما يتم تنقيته من مصفوفة EHS التي تباع باسم Matrigel) ، ولكن لا توفر جميع المصادر بروتينا سليما وغير متحلل.
<ol><li>تأكد من أن Ln1 لا يتحلل عن طريق الحصول على Ln1 وتشغيل كروماتوغرافيا استبعاد الحجم26 أو الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد26. يجب أن يحتوي Ln1 المشوه على نطاقات عند 337 كيلو دالتون و 197 كيلو دالتون و 177 كيلو دالتون ، ويجب أن يكون ل Ln1 الأصلي نطاق واحد عند 711 كيلو دالتون.</li>
	<li>قم بإذابة Ln1 على الثلج في الثلاجة طوال الليل ، وقم بالقسمة في أنابيب طرد مركزي دقيقة منخفضة البروتين (عادة ما تكون القسمة عند 100 ميكروغرام / أنبوب لتراكبات الاستزراع ، أو 10 ميكروغرام للطلاء) باستخدام أطراف ربط منخفضة البروتين وتقنية معقمة27. تجمد القسامات وتخزن في درجة حرارة -80 درجة مئوية.</li>
</ol>2. بلمرة اللامينين باستخدام مخازن منخفضة الأس الهيدروجيني

<ol><li>اصنع عازلة للبلمرة polyLM: قم بوزن وخلط 1 mM CaCl2 و 20 mM من أسيتات الصوديوم في ماء فائق النقاء. ثم اضبط الرقم الهيدروجيني على 4.0 ، باستخدام حمض الهيدروكلوريك أو حمض الخليك. مرشح معقم من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر ، ويخزن في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>اصنع مخزن بلمرة التحكم: امزج 1 mM CalCl2 و 20 mM Tris واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0 ، باستخدام 10 N HCl أو 12 N NaOH حسب الضرورة. مرشح معقم من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر ، ويخزن في 4 درجات مئوية. ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.</li>
	<li>قم بإذابة العدد المطلوب من قسامات Ln-1 في الثلاجة طوال الليل.</li>
	<li>باستخدام تقنية زراعة الخلايا المعقمة ، أضف المخزن المؤقت المناسب (إما مخزن بلمرة polyLM من الخطوة 2.1 أو مخزن بلمرة التحكم من الخطوة 2.2) إلى قسامات اللامينين بتركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام / مل (أي أضف 0.5 مل إلى 50 ميكروغرام من القسامة) واخلطها برفق عن طريق الماصة.</li>
	<li>في حالة استخدام اللامينين الموسوم بالفلورسنت للتصور ، أعد تكوينه وأضفه بنسبة 1:50 وزن / وزن (على سبيل المثال 2 ميكروغرام / 100 ميكروغرام) واخلطه برفق عن طريق الماصة. ملاحظة: في حالة استخدام اللامينين كركيزة لمرفق الخلية ، اتبع الخطوات 2.6-2.8:</li>
	<li>مباشرة بعد التخفيف في المخزن المؤقت المناسب ، انقل الصفيحات إلى بلاستيك أو الأواني الزجاجية واحتضانها طوال الليل في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية. لاحظ أنه عند طلاء أغطية الغطاء ، أضف حجما كبيرا بما يكفي لإنتاج انخفاض متوازن (عادة ، استخدم 50 ميكرولتر لغطاء دائري 13 مم) ، واحفظه في غرفة مرطبة طوال الليل عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>باستخدام تقنية معقمة27 ، يغسل مع 1x محلول ملحي مخزن الفوسفات (PBS).</li>
	<li>قم بإزالة السائل بعناية. لا تدع السطح يجف تماما. ملاحظة: في حالة استخدام اللامينين لتغطية الخلايا لتحريض بروتين الحليب ، اتبع الخطوات 2.9-2.12:</li>
	<li>ثقافة الخلايا الظهارية الثديية. ثقافة MepG dystroglycan يطرق في (DgKI) أو MepG خلايا الضربة القاضية dystroglycan (DgKO) الخلايا في DMEM-F12 تستكمل مع 2 ٪ FBS ، 0.01 ملغ / مل الأنسولين ، 0.005 ميكروغرام / مل EGF ، 0.05 ملغ / مل جنتاميسين ، و 0.05 غرام / مل نورموسين.</li>
	<li>بذور خلايا DgKO و DgKI لتحفيز اللامينين عند 10500 خلية / سم2 في أطباق البئر أو أطباق قاع الغطاء</li>
	<li>احتضان اللامينين المخفف في حاضنة زراعة الخلايا على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>قسام polyLM لأجهزة الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 20 دقيقة ، ولكن أجهزة الطرد المركزي LM في درجة حموضة محايدة عند 20000 × جم لمدة 20 دقيقة بسبب الحجم الأصغر لكيانات البروتين والحاجة إلى سرعات أعلى للتجميع بفعالية.</li>
	<li>باستخدام تقنيةالتعقيم 27 ، قم بإزالة المادة الطافية برفق ، وأعد تعليقها في حجم مناسب من وسط الحث DMEM-F12 المكمل ب 3 ميكروغرام / مل برولاكتين ، 2.8 ميكرومتر هيدروكورتيزون ، و 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين</li>
	<li>نقل اللامينين في وسط زراعة الخلايا على الفور لتحفيز الخلايا. لقد نجحنا في تحفيز الخلايا باستخدام 50-800 ميكروغرام / مل Ln1</li>
</ol>3. بلمرة اللامينين باستخدام البروتينات السكرية المعزولة
<ol><li>قم بإذابة nidogen-1 و Ln1 المؤتلف برفق على الثلج في الثلاجة طوال الليل.</li>
	<li>امزج Ln1 مع nidogen-1 بنسبة 1: 1 بالوزن / الوزن في وسط زراعة الخلايا باستخدام أطراف وأنابيب ربط منخفضة البروتين وباستخدام تقنية معقمة. استخدم Ln1 النقي في وسط زراعة الخلايا كعنصر تحكم.</li>
	<li>في حالة استخدام اللامينين الموسوم بالفلورسنت للتصور ، أعد تكوينه وأضفه بنسبة 1:50 بالوزن / الوزن (على سبيل المثال ، 2 ميكروغرام / 100 ميكروغرام). تخلط بلطف عن طريق الماصة.</li>
	<li>احتضان Ln1-nidogen أو التحكم في Ln1 في حاضنة زراعة الخلايا على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>البوليمرات المشتركة للطرد المركزي Ln1-nidogen عند 2000 × جم لمدة 30 دقيقة والتحكم Ln1 عند 20000 × جم لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>قم بإزالة المادة الطافية برفق وأعد تعليقها في وسط زراعة الخلايا إلى تركيز نهائي يتراوح بين 100-800 ميكروغرام من البروتين الكلي / مل.</li>
	<li>استخدميه على الفور لتحفيز الخلايا ، أو انقله إلى أغطية الغطاء واتركه يلتصق طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنات زراعة الخلايا المرطبة.</li>
	<li>قم بإزالة وسط الثقافة من أغطية الغطاء ، واغسل أغطية الغطاء باستخدام 1x PBS ، ثم ثبته بنسبة 10٪ فورمالين (أي 4٪ فورمالديهايد في PBS) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
</ol>4. بلمرة اللامينين باستخدام خلايا التعبير عن الديستروغليكان
<ol><li>ثقافة الخلايا الظهارية الثديية. ثقافة MepG dystroglycan يطرق في (DgKI) أو MepG خلايا الضربة القاضية dystroglycan (DgKO) الخلايا في DMEM-F12 تستكمل مع 2 ٪ FBS ، 0.01 ملغ / مل الأنسولين ، 0.005 ميكروغرام / مل EGF ، 0.05 ملغ / مل جنتاميسين ، و 0.05 غرام / مل نورموسين.</li>
	<li>خلايا البذور DgKI عند 5000 خلية / سم2 ، وخلايا DgKO البذور عند 8000 خلية / سم2 بسبب الاختلافات في معدلات النمو. استزراع عند 37 درجة مئوية في حاضنات مرطبة مع تغيير الوسائط كل 2-3 أيام وممرات كل 4-5 أيام باستخدام تقنية معقمة صارمة. عد الخلايا بعناية باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلاياالآلي 27 لضمان معدلات النمو المناسبة.</li>
	<li>خلايا البذور لتحفيز اللامينين عند 10500 خلية / سم2 في أطباق البئر أو أطباق قاع الغطاء والاستزراع لمدة يومين ، باستخدام خلايا DgKI لتوليد خلايا كسورية Ln1 و DgKO كضوابط سلبية. قم بإذابة Ln-1 برفق طوال الليل على الثلج في الثلاجة ، ثم امزجه مع وسيط الحث DMEM-F12 المكمل ب 3 ميكروغرام / مل برولاكتين ، 2.8 ميكرومتر هيدروكورتيزون ، و 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين. بالنسبة لطبق 35 مم ، استخدم 1 مل من الوسائط الحثية مع 50-800 ميكروغرام من Ln1.</li>
	<li>في حالة استخدام الفلورسنت Ln1 ، امزج بنسبة 50: 1 بالوزن / الوزن.</li>
	<li>إزالة الوسائط من الخلايا ، وتغطيتها باللامينين والوسائط الحثية من DMEM-F12 المكمل ب 3 ميكروغرام / مل برولاكتين ، 2.8 ميكرومتر هيدروكورتيزون ، و 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين</li>
	<li>خلايا الثقافة لمدة 2 أيام ، ثم إصلاح مع 10 ٪ الفورمالين.</li>
</ol>5. توصيف البنية المجهرية لللامينين عن طريق الفحص المجهري الضوئي
<ol><li>اجمع عينات ثابتة واغسلها 3 مرات باستخدام 1x PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>قم بحظر العينات واختراقها في 1x PBS مع 0.5٪ Triton X-100 ، و 3٪ ألبومين مصل بقري ، و 10٪ مصل ماعز ، و 40 ميكروغرام / مل شظية الأجسام المضادة المضادة للفأر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة. ملاحظة: Triton X-100 خطير. تعامل مع القفازات وحماية العين وتخلص منها بشكل مناسب.</li>
	<li>امزج الأجسام المضادة المضادة لللامينين بتخفيف 1: 100 مع 1x PBS مع 0.5٪ Triton X-100 و 3٪ BSA وأضفه إلى العينات لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية في غرفة مرطبة (عادة ما تستخدم صناديق الأطراف مع مسح مختبر مبلل في الأسفل).</li>
	<li>قم بإزالة الأجسام المضادة الأولية واغسلها 3 مرات باستخدام 1x PBS مع 0.5٪ Triton X-100 و 3٪ BSA.</li>
	<li>أضف جسما مضادا ثانويا مناسبا بتخفيف 1: 500 إلى العينات في 1x PBS مع 0.5٪ Triton X-100 و 3٪ BSA واحتضانها في درجة حرارة الغرفة في الظلام في غرفة مرطبة.</li>
	<li>قم بإزالة الأجسام المضادة الثانوية واغسلها 3 مرات باستخدام 1x PBS مع 0.5٪ Triton X-100 و 3٪ BSA.</li>
	<li>بالنسبة للعينات التي تحتوي على خلايا ، أضف 6 ميكرومتر من القضيب لمدة 45 دقيقة ، متبوعا ب 3 غسلات مع PBS مع 0.5٪ Triton X-100 و 3٪ BSA ، متبوعا ب 3 غسلات مع PBS. ثم تلطخ ب 0.1 ميكروغرام / مل DAPI في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>قم بتركيب العينات إذا كان ذلك مناسبا.</li>
	<li>هيكل الصورة ln-1 باستخدام المجهر متحد البؤر عالي الدقة. استخدم مجهر المسح بالليزر المجهز بأهداف الغمر (خطة الغمر في الماء Apochromat 40X / 1.1NA أو خطة الغمر بالزيت Apochromat 63X / 1.4NA).</li>
</ol>6. توصيف تركيبات اللامينين عبر أبعاد عد الصناديق
<ol><li>قم بتحليل خصائص الفركتلات باستخدام خوارزميات أبعاد عد الصناديق المتوفرة في صناديق أدوات Matlab أو في ImageJ. هذه الطرق عتبة صور laminin ورسم على سجل سجل رسم عدد المربعات التي تحتوي على Ln1 مقارنة بحجم الصناديق. ميل العلاقة بين هذه المعلمات هو بعد عد المربعات: سيكون للهندسة غير الفركتالية بعد 0 أو 1 أو 2 ، في حين أن الهندسة الكسورية لها بعد غير صحيح28. ملاحظة: المعالجة بالحمض والمعالجة بالبروتين السكري و DgKI المرتبطة بالخلايا Ln1 جميعها لها بعد كسورية عد الصناديق ~ 1.7 ، في حين أن التحكم Ln1 له بعد كسورية 2.0.</li>
</ol>7. توصيف تركيبات اللامينين عن طريق المجهر الإلكتروني
<ol><li>أعد تعليق الصفيحات في وسط زراعة الخلايا واتركها تمتص رقائق السيليكا لمدة 90 دقيقة في بيئة رطبة تبلغ 37 درجة مئوية.</li>
	<li>إصلاح المصفوفات في 2.5٪ جلوتارالدهيد في 0.1 M كاكوديلات الصوديوم العازلة عند درجة الحموضة 7.2. ملاحظة: الجلوتارالدهيد خطير ويجب التعامل معه في غطاء دخان مع قفازات وحماية للعين والتخلص منه كنفايات خطرة.</li>
	<li>مصفوفات Postfix في رابع أكسيد الأوزميوم 1٪ في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 M عند الرقم الهيدروجيني 7.2. ملاحظة: رابع أكسيد الأوزميوم خطير ويجب التعامل معه في غطاء دخان مع قفازات وحماية للعين والتخلص منه بشكل مناسب. الكاكوديلات خطير ويجب التعامل معه في غطاء دخان مع قفازات وحماية للعين والتخلص منه بشكل مناسب.</li>
	<li>يغسل 3 مرات في المخزن المؤقت كاكوديلات الصوديوم عند درجة الحموضة 7.2.</li>
	<li>يجفف مع زيادة تركيزات الإيثانول.</li>
	<li>رش مصفوفات معطف بطبقة رقيقة من الذهب.</li>
	<li>صورة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+control+of+invasive+tumor+cell+behavior+by+extracellular+matrix+microarchitecture.">Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture.</a> Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening+and+unfolding+of+early+deposited-fibronectin+increase+proangiogenic+factor+secretion+by+breast+cancer-associated+stromal+cells.">Stiffening and unfolding of early deposited-fibronectin increase proangiogenic factor secretion by breast cancer-associated stromal cells.</a> Biomaterials. 54, 63-71 (2015).</li><li>Bruekers, S. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin-fiber+architecture+influences+cell+spreading+and+differentiation.">Fibrin-fiber architecture influences cell spreading and differentiation.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 10 (5), 495-504 (2016).</li><li>Yurchenco, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+Activities+of+Laminins+that+Drive+Basement+Membrane+Assembly+and+Function.">Integrating Activities of Laminins that Drive Basement Membrane Assembly and Function.</a> Curr Top Membr. 76, 1-30 (2015).</li><li>Colognato, H., Winkelmann, D. A., Yurchenco, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+Polymerization+Induces+a+Receptor-Cytoskeleton+Network.">Laminin Polymerization Induces a Receptor-Cytoskeleton Network.</a> The Journal of Cell Biology. 145 (3), 619-631 (1999).</li><li>Powell, S. K., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+laminins+and+their+cellular+receptors.">Neuronal laminins and their cellular receptors.</a> International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 29 (3), 401-414 (1997).</li><li>Li, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+a+reconstituted+basement+membrane+and+its+components+on+casein+gene+expression+and+secretion+in+mouse+mammary+epithelial+cells.">Influence of a reconstituted basement membrane and its components on casein gene expression and secretion in mouse mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (1), 136-140 (1987).</li><li>Fiore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-111+and+the+Level+of+Nuclear+Actin+Regulate+Epithelial+Quiescence+via+Exportin-6.">Laminin-111 and the Level of Nuclear Actin Regulate Epithelial Quiescence via Exportin-6.</a> Cell Rep. 19 (10), 2102-2115 (2017).</li><li>Inman, J. L., Robertson, C., Mott, J. D., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+gland+development:+cell+fate+specification,+stem+cells+and+the+microenvironment.">Mammary gland development: cell fate specification, stem cells and the microenvironment.</a> Development. 142 (6), 1028-1042 (2015).</li><li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).</li><li>Furuta, S., Ren, G., Mao, J. -. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+signals+initiate+the+reciprocal+loop+that+informs+breast-specific+gene+expression+and+homeostasis+by+activating+NO,+p53+and+microRNAs.">Laminin signals initiate the reciprocal loop that informs breast-specific gene expression and homeostasis by activating NO, p53 and microRNAs.</a> eLife. 7, 26148 (2018).</li><li>Brown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophic+phenotype+induced+in+vitro+by+antibody+blockade+of+muscle+alpha-dystroglycan-laminin+interaction.">Dystrophic phenotype induced in vitro by antibody blockade of muscle alpha-dystroglycan-laminin interaction.</a> Journal of Cell Science. 112 (2), 209 (1999).</li><li>Calof, A. L., Campanero, M. R., O'Rear, J. J., Yurchenco, P. D., Landert, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain-specific+activation+of+neuronal+migration+and+neurite+outgrowth-promoting+activities+of+laminin.">Domain-specific activation of neuronal migration and neurite outgrowth-promoting activities of laminin.</a> Neuron. 13 (1), 117-130 (1994).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-sulfatide+binding+initiates+basement+membrane+assembly+and+enables+receptor+signaling+in+Schwann+cells+and+fibroblasts.">Laminin-sulfatide binding initiates basement membrane assembly and enables receptor signaling in Schwann cells and fibroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 169 (1), 179-189 (2005).</li><li>Sonnenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+recognition+of+different+cell-binding+fragments+of+laminin+(P1,+E3,+E8)+and+evidence+that+alpha+6+beta+1+but+not+alpha+6+beta+4+functions+as+a+major+receptor+for+fragment+E8.">Integrin recognition of different cell-binding fragments of laminin (P1, E3, E8) and evidence that alpha 6 beta 1 but not alpha 6 beta 4 functions as a major receptor for fragment E8.</a> The Journal of Cell Biology. 110 (6), 2145-2155 (1990).</li><li>Sorokin, L., Sonnenberg, A., Aumailley, M., Timpl, R., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+the+laminin+E8+cell-binding+site+by+an+integrin+possessing+the+alpha+6+subunit+is+essential+for+epithelial+polarization+in+developing+kidney+tubules.">Recognition of the laminin E8 cell-binding site by an integrin possessing the alpha 6 subunit is essential for epithelial polarization in developing kidney tubules.</a> The Journal of Cell Biology. 111 (3), 1265-1273 (1990).</li><li>Horejs, C. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologically-active+laminin-111+fragment+that+modulates+the+epithelial-to-mesenchymal+transition+in+embryonic+stem+cells.">Biologically-active laminin-111 fragment that modulates the epithelial-to-mesenchymal transition in embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5908-5913 (2014).</li><li>Hochman-Mendez, C., Cantini, M., Moratal, D., Salmeron-Sanchez, M., Coelho-Sampaio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fractal+Nature+for+Polymerized+Laminin.">A Fractal Nature for Polymerized Laminin.</a> PLOS ONE. 9 (10), 109388 (2014).</li><li>Kent, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microstructure+of+laminin-111+compensates+for+dystroglycan+loss+in+mammary+epithelial+cells+in+downstream+expression+of+milk+proteins.">The microstructure of laminin-111 compensates for dystroglycan loss in mammary epithelial cells in downstream expression of milk proteins.</a> Biomaterials. 218, 119337 (2019).</li><li>Weir, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystroglycan+loss+disrupts+polarity+and+beta-casein+induction+in+mammary+epithelial+cells+by+perturbing+laminin+anchoring.">Dystroglycan loss disrupts polarity and beta-casein induction in mammary epithelial cells by perturbing laminin anchoring.</a> Journal of Cell Science. 119, 4047-4058 (2006).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Palmero, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+follicular+thyroid+cell+line+PCCL3+responds+differently+to+laminin+and+to+polylaminin,+a+polymer+of+laminin+assembled+in+acidic+pH.">The follicular thyroid cell line PCCL3 responds differently to laminin and to polylaminin, a polymer of laminin assembled in acidic pH.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 376 (1), 12-22 (2013).</li><li>Hochman-Mendez, C., Lacerda de Menezes, J. R., Sholl-Franco, A., Coelho-Sampaio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polylaminin+recognition+by+retinal+cells.">Polylaminin recognition by retinal cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 92 (1), 24-34 (2014).</li><li>Leal-Lopes, C., Grazioli, G., Mares-Guia, T. R., Coelho-Sampaio, T., Sogayar, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerized+laminin+incorporation+into+alginate-based+microcapsules+reduces+pericapsular+overgrowth+and+inflammation.">Polymerized laminin incorporation into alginate-based microcapsules reduces pericapsular overgrowth and inflammation.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 13 (10), 1912-1922 (2019).</li><li>Paccola Mesquita, F. C., Hochman-Mendez, C., Morrissey, J., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+as+a+Potent+Substrate+for+Large-Scale+Expansion+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Closed+Cell+Expansion+System.">Laminin as a Potent Substrate for Large-Scale Expansion of Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Closed Cell Expansion System.</a> Stem Cells International. 2019, 9 (2019).</li><li>Walker, J. M., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Protein Protocols Handbook. , 61-67 (2002).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques. 7th edition. , (2016).</li><li>Mandelbrot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Fractal Geometry of Nature. , (1982).</li><li>Schittny, J. C., Yurchenco, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+short+arm+domains+of+basement+membrane+laminin+are+critical+for+its+self-assembly.">Terminal short arm domains of basement membrane laminin are critical for its self-assembly.</a> Journal of Cell Biology. 110 (3), 825-832 (1990).</li><li>Schuger, L., Yurchenco, P., Relan, N. K., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+fragment+E4+inhibition+studies:+basement+membrane+assembly+and+embryonic+lung+epithelial+cell+polarization+requires+laminin+polymerization.">Laminin fragment E4 inhibition studies: basement membrane assembly and embryonic lung epithelial cell polarization requires laminin polymerization.</a> International Journal of Developmental Biology. 42 (2), 217-220 (1998).</li><li>Colognato, H., Yurchenco, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form+and+function:+the+laminin+family+of+heterotrimers.">Form and function: the laminin family of heterotrimers.</a> Developmental Dynamics. 218 (2), 213-234 (2000).</li><li>Kabaeva, Z., Meekhof, K. E., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcolemma+instability+during+mechanical+activity+in+Large+myd+cardiac+myocytes+with+loss+of+dystroglycan+extracellular+matrix+receptor+function.">Sarcolemma instability during mechanical activity in Large myd cardiac myocytes with loss of dystroglycan extracellular matrix receptor function.</a> Human Molecular Genetics. 20 (17), 3346-3355 (2011).</li></ol>

تم تنفيذ هذا العمل تحت رعاية وزارة الطاقة الأمريكية من قبل مختبر لورانس ليفرمور الوطني بموجب العقد DE-AC52-07NA27344. إصدار الدردشة LLNL-JRNL-799443.

تمثل اللامينين عنصرا أساسيا في ECM في أنظمة الأعضاء الظهارية والعضلية والعصبية ، وقد ثبت في المختبر أنها تلعب أدوارا أساسية في تنظيم التمايز الوظيفي للخلايا. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن بنية اللامينين المعروضة على الخلايا تنظم إشاراتها والنمط الظاهري للخليةالناتج 15،<s...

على عكس عوامل النمو أو السيتوكينات ، يمكن أن تتجمع بروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) في شبكات هيكلية. نظرا لأن الخلل الوظيفي في ECM هو عنصر أساسي في العديد من الحالات المرضية ، فإن الآليات التي تستشعر بها الخلايا الإشارات وتنقلها من تكوين ECM والبنية المجهرية والميكانيكا الحيوية هي أهداف جذابة للتطوير العلاجي. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن البنية المجهرية لهذه الشبكات تلعب دورا رئيسيا في كيفية إشارة هذه البروتينات إلى الخلايا. حتى الآن ، تم إظهار هذا الارتباط بين البنية المجهرية ECM ووظيفة الخلية للكولاجين I1 و fibronectin2 و fibrin3.
Laminin-111 (Ln1) هو بروتين ثلاثي الشكل متقاطع يعد مكونا هيكليا رئيسيا للمصفوفة خارج الخلية التي تتصل بالخلايا الظهارية4 وخلايا العضلات5 والخلايا العصبية6. في الغدة الثديية ، Ln1 ضروري للتمايز الوظيفي للخلايا الظهارية للغدة الثديية إلى خلايا منتجة للحليب 7،8،9 ، و Ln1 ضروري لتحريض ارتداد الورم10،11. Ln1 وغيرها من الصفيحات ضرورية لتطوير شبكات الأكتين القشرية وتنظيم الساركوليما في العضلات12،13 ، ولهجرة الخلايا العصبية ونمو الخلايا العصبية13 . وبالتالي ، فإن فهم الآليات التي يشير بها اللامينين إلى الخلايا هو مجال نشط للبحث.
يحتوي Ln1 على مجالات لاصقة متعددة لمجموعة واسعة من المستقبلات بما في ذلك الانتغرينات ، والسينديكان ، والديستروغليكان ، و LBP-110 و LamR (الشكل 1A) 4,14. جزء E8 ، الذي يحتوي على المجالات الكروية c-terminus من laminin α1 ، ضروري لربط dystroglycan و integrins α6β1 و α3β115 ، وهو ضروري للتمايز الوظيفي للخلايا الظهارية 15,16. في المقابل ، تظهر الأذرع القصيرة نشاطا بيولوجيا مختلفا17 ، مما يعني أن توفر التعرف على مجال Ln1 المختلف بعد تكوين الشبكة يمكن أن يغير سلوك الخلية.
لقد أثبتنا مؤخرا أن Ln1 مرتبة في شبكة بوليمرية تعرض خصائص كسورية (أي بنية متشابهة ذاتيا عبر مقاييس طول متعددة)18. تشير الشبكات الكسورية بشكل مختلف إلى الخلايا الظهارية مقارنة ب Ln1 ، الذي يفتقر إلى هذا الترتيب19. تشير هذه الشبكة الكسورية إلى بنية تجميع معينة ، حيث يتعرض الذراع الطويل بشكل تفضيلي للخلايا18. نتيجة لهذا العرض المختلف للذراع الطويلة ، تخضع الخلايا الظهارية للتمايز الوظيفي إلى خلايا منتجة للحليب ذات تقاطعات ضيقة جيدة التنظيم وقمع ألياف إجهاد الأكتين19.
وصفنا 3 طرق لتوليد شبكات Ln1 من تفاعلات ربط الذراع القصيرة والذراع القصيرة ، والتي تظهر عرضا عاليا للذراع الطويلة Ln1: 1) عن طريق التجميع الخالي من الخلايا مع المخازن المؤقتة الحمضية ، 2) عن طريق الحضانة المشتركة مع البروتينات السكرية ، أو 3) عن طريق التفاعل مع سطح الخلية dystroglycan. تولد هذه الطرق الثلاث هياكل مجهرية متشابهة لللامينين من خلال ثلاث آليات مختلفة للغاية ، مما يسمح بالمرونة في التصميم التجريبي. تشير الأبحاث السابقة إلى أن هذه الطرق الثلاث يمكن أن تمثل المتانة البيولوجية: في الغدة الثديية epithelia، يمكن أن يؤدي إما ديستروغليكان سطح الخلية أو البروتينات السكرية أو اللامينين ذو البنية الاصطناعية إلى تحفيز التمايز الوظيفي19. وبالتالي ، يمكن للباحثين الاختيار بين هذه الطرق بناء على موضوع الدراسة: لا تظهر خلايا التعبير عن dystroglycan أي حساسية للبنية المجهرية Ln-1 ، حيث أن dystroglycan في غشاء الخلية يحفز البلمرة الصحيحة في شبكة كسورية19,20. يمثل Matrigel ، وهو مزيج من laminins والبروتينات السكرية21 ، المصدر الأكثر اقتصادا ل Ln-1 ، ويوفر البنية المجهرية اللازمة لحث الخلايا الثديية dystroglycan بالضربة القاضية على التمييزبين 20 ، ولكنه يحتوي على مزيج معقد من البروتينات مع الكثير من التباين إلى الكثير. يمثل PolyLM النظام الأنظف والأكثر اختزالا الذي يوفر هذه الوظيفة ، ولكن بتكلفة متزايدة وفعالية أقل للحث على تمايز الخلايا الثديية مقارنة ب Matrigel19.
هذه الطرق الثلاث لها بنية شبكة كسورية مميزة للتجميع المحدود للانتشار18،19 ، وتظهر نشاطا بيولوجيا متغيرا مقارنة باللامينين المجمع في أنظمة تجريبية متعددة22،23،24،25. يمكن للدراسات المستقبلية باستخدام هذه الطرق تحديد المستقبلات والإشارات اللازمة للتمايز الظهاري وتحديد استعادة تفاعلات مصفوفة الخلايا الطبيعية في الخلايا في البيئات الدقيقةغير الطبيعية 20 ، مثل الأورام.

<table><tbody><tr><td>10% formalin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Laminin primary antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody</td><td>Thermo</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901 or similar</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Incubator</td><td>Thermo</td><td>Heracell 150 or similar</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge for microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>5418 or similar</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710 or equivalent</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Thermo</td><td>25CIR-1 or similar</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red</td><td>Thermo</td><td>11330107</td><td></td></tr><tr><td>EGF (Epidermal Growth Factor)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11376454001</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescently Labeled Laminin</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>LMN02</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>VWR</td><td>VWRV0304-10G</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331 or similar</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888-5G</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16634-50mg</td><td></td></tr><tr><td>MepG Dystroglycan Knockout Cells</td><td>LBNL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045 or similar</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75633</td><td></td></tr><tr><td>Ovine Prolactin</td><td>Los Angeles Biomedical Research Institute</td><td>Ovine Pituitary Prolactin</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Thermo</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Thermo</td><td>10010023 or similar</td><td></td></tr><tr><td>Purified Laminin-111</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human Nidogen-1, carrier free</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>2570-ND-050</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889 or similar</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cacodylate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filters</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS or similar</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252859 or similar</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-low protein binding tubes</td><td>VWR</td><td>76322-516, 76322-522 or similar</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Thermo</td><td>15230253 or similar</td><td></td></tr></tbody></table>

generating a fractal microstructure of laminin-111 to signal to cells

Laminin-111 (Ln1) هو جزء أساسي من المصفوفة خارج الخلية في epithelia, العضلات والنظم العصبية. لقد أثبتنا سابقا أن البنية المجهرية ل Ln1 تغير الطريقة التي تشير بها إلى الخلايا ، ربما لأن تجميع Ln1 في الشبكات يكشف عن مجالات لاصقة مختلفة. في هذا البروتوكول ، نصف ثلاث طرق لتوليد Ln1 المبلمر.

Laminin-111 هو بروتين ثلاثي مع ثلاثة مجالات ذاتية التجميع في نهاية أذرعه القصيرة (الشكل 1 أ). عند معالجتها بشكل مناسب ، يمكن أن تتبلمر الأذرع القصيرة إلى شبكة سداسية (الشكل 1ب ، 1 ج) ، والتي تعرض خصائص كسورية مجمعة محدودة الانتشار على نطاقات مكانية أكبر (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Generating a Fractal Microstructure of Laminin-111 to Signal to Cells at JoVE.com

Generating a Fractal Microstructure of Laminin-111 to Signal to Cells

وصفنا ثلاث طرق لتوليد بوليمرات Ln1 ذات خصائص كسورية تشير إلى الخلايا بشكل مختلف مقارنة ب Ln1 غير المبلمر.

توليد بنية مجهرية كسورية من Laminin-111 للإشارة إلى الخلايا

Laminin-111 (Ln1) is an essential part of the extracellular matrix in epithelia, muscle and neural systems. We have previously demonstrated that the ...

generating-a-fractal-microstructure-of-laminin-111-to-signal-to-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

921 Views.  Texas Heart Institute. وصفنا ثلاث طرق لتوليد بوليمرات Ln1 ذات خصائص كسورية تشير إلى الخلايا بشكل مختلف مقارنة ب Ln1 غير المبلمر.

Video: Generating a Fractal Microstructure of Laminin-111 to Signal to Cells

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

إنشاء ثنائي الأبعاد ركائز منقوشة على الحبس البروتين والخلايا

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber diameter, composition and organization. In addition to providing structural support, the physical and chemical properties of the ECM play an important role in multiple cellular processes including adhesion, differentiation, and apoptosis. In vivo, the ECM is assembled by exposing cryptic self-assembly (fibrillogenesis) sites within proteins. This process varies for different proteins, but fibronectin (FN) fibrillogenesis is well-characterized and serves as a model system for cell-mediated ECM assembly. Specifically, cells use integrin receptors on the cell membrane to bind FN dimers and actomyosin-generated contractile forces to unfold and expose binding sites for assembly into insoluble fibers. This receptor-mediated process enables cells to assemble and organize the ECM from the cellular to tissue scales. Here, we present a method termed surface-initiated assembly (SIA), which recapitulates cell-mediated matrix assembly using protein-surface interactions to unfold ECM proteins and assemble them into insoluble fibers. First, ECM proteins are adsorbed onto a hydrophobic polydimethylsiloxane (PDMS) surface where they partially denature (unfold) and expose cryptic binding domains. The unfolded proteins are then transferred in well-defined micro- and nanopatterns through microcontact printing onto a thermally responsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) surface. Thermally-triggered dissolution of the PIPAAm leads to final assembly and release of insoluble ECM protein nanofibers and nanostructures with well-defined geometries. Complex architectures are possible by engineering defined patterns on the PDMS stamps used for microcontact printing. In addition to FN, the SIA process can be used with laminin, fibrinogen and collagens type I and IV to create multi-component ECM nanostructures. Thus, SIA can be used to engineer ECM protein-based materials with precise control over the protein composition, fiber geometry and scaffold architecture in order to recapitulate the structure and composition of the ECM in vivo.

A method to obtain nanofibers and complex nanostructures from single or multiple extracellular matrix proteins is described. This method uses protein-surface interactions to create free-standing protein-based materials with tunable composition and architecture for use in a variety of tissue engineering and biotechnology applications.

ألياف النانو البروتين ECM والنانو المهندسة طريق الجمعية بمبادرة السطحية

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration in more appropriate 3D environments, which better resemble the dimensionality of the physiological processes in question. Migratory cells can substantially differ in their morphology and mode of migration depending on whether they are moving on 2D or 3D substrates. Due to technical difficulties and incompatibilities with most standard protocols, structural and functional analysis of cells embedded within 3D matrices still remains uncommon. This article describes methods for preparation and imaging of 3D cancer cell cultures, either as single cells or spheroids. As an appropriate ECM substrate for cancer cell migration, we use nonpepsinized rat tail collagen I polymerized at room-temperature and fluorescently labeled to facilitate visualization using standard confocal microscopes. This work also includes a protocol for 3D immunofluorescent labeling of endogenous cell cytoskeleton. Using these protocols we hope to contribute to a better description of the molecular composition, localization, and functions of cellular structures in 3D.

This article presents a method to fluorescently label collagen that can be further used for both fix and live imaging of 3D cell cultures. We also provide an optimized protocol to visualize endogenous cytoskeletal proteins of cells cultured in 3D environments.

وكشف عن المنظمة هيكل الخلية من خلايا سرطان الغازية في 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

Medicine

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microenvironments-شطيرة مثل لتسخير خلية / المواد التفاعلات

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

الأنسجة الطلائية الهندسة ثلاثي الأبعاد جزءا لا يتجزأ من داخل خارج الخلية مصفوفة

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

صالحة يجند نانو الكتلة في الدهن طبقة ثنائية المعتمدة

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or tissues. Up to date, most in vitro systems rely on two-dimensional (2D) surfaces, such as cell-culture plates or coverslips. To optimally mimic physiological conditions in vitro, we utilize a simple 3D collagen matrix. Collagen is one of the major components of extracellular matrix (ECM) and has been widely used to constitute 3D matrices. For 3D imaging, the recently developed light-sheet microscopy technology (also referred to as single plane illumination microscopy) is featured with high acquisition speed, large penetration depth, low bleaching, and photocytotoxicity. Furthermore, light-sheet microscopy is particularly advantageous for long-term measurement. Here we describe an optimized protocol how to set up and handle human immune cells, e.g. primary human cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells in the 3D collagen matrix for usage with the light-sheet microscopy for live cell imaging and fixed samples. The procedure for image acquisition and analysis of cell migration are presented. A particular focus is given to highlight critical steps and factors for sample preparation and data analysis. This protocol can be employed for other types of suspension cells in a 3D collagen matrix and is not limited to immune cells.

Here, we present a protocol to visualize immune cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen matrix using light-sheet microscopy. This protocol also elaborates how to track cell migration in 3D. This protocol can be employed for other types of suspension cells in the 3D matrix.

النور-ورقة الفحص المجهري للتصور ثلاثي الأبعاد للخلايا المناعية البشرية

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

Immunology and Infection

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

إعداد Tunable خارج الخلية مصفوفة microenvironments لتقييم شوان الخلية الظاهري مواصفات

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer length scale allows the use of these patterned contact zones for the measurement of traction forces, as each micropatterned dot allows for the formation of a single focal adhesion that then deforms the soft, underlying hydrogel. This approach has been used for a wide range of cell types, including endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, platelets, and epithelial cells. 
This review describes the evolution of techniques that allow the printing of extracellular matrix proteins onto polyacrylamide hydrogels in a regular array of dots of prespecified size and spacing. As micrometer-scale patterns are difficult to directly print onto soft substrates, patterns are first generated on rigid glass coverslips that are then used to transfer the pattern to the hydrogel during gelation. First, the original microcontact printing approach to generate arrays of small dots on the coverslip is described. A second step that removes most of the pattern to leave islands of small dots is required to control the shapes of cells and cell clusters on such arrays of patterned dots. 
Next, an evolution of this approach that allows for the generation of islands of dots using a single subtractive patterning step is described. This approach is greatly simplified for the user but has the disadvantage of a decreased lifetime for the master mold needed to make the patterns. Finally, the computational approaches that have been developed for the analysis of images of displaced dots and subsequent cell-generated traction fields are described, and updated versions of these analysis packages are provided.

We describe improvements to a standard method for measuring cellular traction forces, based on microcontact printing with a single subtractive patterning step of dot arrays of extracellular matrix proteins on soft hydrogels. This method allows for simpler and more consistent fabrication of island patterns, essential for controlling cell cluster shape.

توليد النمط لمجهر الجر المجهري

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

الامتزاز الجزيئي المستحث بالضوء من البروتينات باستخدام نظام بريمو لزخرفه الصغرى لدراسة استجابات الخلايا للبروتينات المصفوفة خارج الخلية

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...