نود أن نعترف المجموعة بأكملها مورير في جامعة واشنطن التي جعلت المعرفة الجماعية هذا البروتوكول ممكن. يتم توفير التمويل اللازم لهذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة العقلية (1R01MH085495).

1. التحضير للماجستير منقوشة (الشكل 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مركز رقاقة السيليكون على المغطي الجانبية وشطف الرقاقة مع الأسيتون خلال الخطوة الأولى من البرنامج تدور دورة اثنين في الجدول 1. سوف تتبخر خلال الأسيتون الخطوة الثانية من البرنامج تدور ترك نظيفة ، ورقاقة جافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق ما يقرب من 1 مل AZ9245 مقاومة للضوء / في (في قطر) على رقاقة وتدور معطف التي تستخدم الشروط الموضحة في الجدول رقم 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لينة خبز الرقاقة مقاومة للضوء المغلفة على 110 درجة مئوية لمدة 2 متر باستخدام موقد عالية التوحيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Photopattern الركيزة باستخدام نظام ضوئيه المباشر والكتابة أو نظام اليجنر قناع وقناع المناسبة. ويمكن شراء الأقنعة من عدد من المصادر التجارية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الورق الشفاف المطبوعة بالحبر ماصة للأشعة فوق البنفسجية ، لشقة مسجلة بصري ، لإنتاج أنماط مع ميزات كبيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطوير رقاقة منقوشة في مطور 01:02 400K : شبه الموصلات الصف منزوع الأيونات الماء لمدة 1 ق 45 م مع الإثارة لطيف. شطف جيدا مع أشباه الموصلات والماء منزوع الأيونات الصف الجاف مع دفق من النيتروجين (N 2) الغاز. يمكن التحقق من نمط التنمية باستخدام المجهر مع فلتر الأشعة فوق البنفسجية. إذا لم يتم تطويره بالكامل النمط ، ويمكن إرجاعها إلى الرقاقة حل النامية لوقت إضافي. </li></ol> ملاحظة : للحصول على أفضل النتائج ، يجب أن يتم photopatterning في بيئة غرف الأبحاث. 2. إعداد قسائم PDMS (الشكل 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10:01 بواسطة الراتنج الوزن : خليط من 182 تصليب Sylgard (PDMS) ، وتغطي بالكامل الرئيسي (رقاقة photopatterned) مع الخليط في طبق بتري المتاح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دي الغاز PDMS الرئيسية المغطاة في فراغ حتى لا dessicator فقاعات مرئية والسماح للقضاء على شفاء في الفرن على درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة 65 قبل المعالجة ، من المهم التأكد من أن الرئيسي هو في الجزء السفلي من الطبق لأنه قد تطفو على السطح خلال خطوة فصل الغاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع PDMS ختم الخروج من الماجستير وتقليم إلى الحجم المناسب. تخزين الطوابع في وعاء مغطى (الجانب ميزة متابعة) لحمايته من الغبار والحطام. </li></ol> 3. إعداد الركيزة الذهب منقوشة (الشكل 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 25 ملم لا. 1 coverslips الزجاجية المستديرة لترسب المعادن بمعاملتها مع البلازما الأكسجين لمدة 10 متر. شطف مرتين مع الماء منزوع الأيونات MΩ 18.2 تليها مرتين مع الإيثانول والتجفيف مع تيار من غاز 2 N بين كل خطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام نظام متعدد جيب ترسب شعاع الإلكترون ، تليها الودائع 50 التيتانيوم بواسطة الذهب 150. لا تنفيس المبخر بين ترسب طبقة طبقة التيتانيوم والذهب. بدلا من ذلك ، يمكن شراء الذهب المطلي coverslips من مجموعة متنوعة من الموردين ، ومع ذلك ، فمن المهم أن يتم إعداد الطبقات المعدنية بنسبة شعاع الإلكترون التبخر والتبخر لا الحرارية. إذا تم شراؤها من مصدر خارجي ، قد يكون تنظيف ركائز الذهب الأكسدة البلازما أو &quot;سمكة البيرانا&quot; (7:03 اضرب H 2 SO 4 : 30 ٪ H 2 O 2) 11 قبل الاستخدام. </li></ol> ملاحظة : &quot;سمكة البيرانا&quot; الحل هو انفجار في وجود مركبات عضوية. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل ختم و 10 ملم في hexadecanethiol الايثانول المطلق ، والحل الردم ، 1 ملم غليكول منتهية ثيول في الإيثانول المطلق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الطابع مع ​​الإيثانول ويجف تماما مع غاز 2 N. تطبيق ختم حل لقطرة قطرة حتى ختم PDMS مغلفة بشكل كامل. جافة تماما مع الطابع غاز 2 N. انتقل إلى 5A 5B أو عند الاقتضاء على أساس ملامح الطابع PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط برفق على الركيزة ختم الذهب والسماح للأحادي الطبقة لمدة 15 ثانية. النموذج </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الركيزة الذهب في طبق بتري تحتوي على 18.2 ماء منزوع الأيونات MΩ ، وضمان الغارقة الركيزة. اضغط برفق على الركيزة ختم الذهب والسماح للأحادي الطبقة لمدة 15 ثانية. النموذج </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الركيزة ختمها مرتين مع الإيثانول وتجفيف الغاز مع N 2 بعد كل شطف ومكان الركيزة في طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الركيزة مع حل الردم وختم الطبق مع parafilm لمنع التبخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لأحادي الطبقة الخلفية لتكوين في الظلام لمدة 12-14 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ساترة منقوشة من الحل الردم وشطف مرتين مع الإيثانول ، تجفيف الغاز مع N 2 بعد كل شطف. </li></ol> 4. تطبيق البروتين وخلايا منقوشة إلى الركيزة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخزين المؤقت وضع ساترة منقوشة في طبق بتري أو خلية صغيرة غرفة الثقافة ، وتغطي مع 500 ميكرولتر إلى 1 مل من الفوسفات في Dulbecco المالحة (DPBS). يجب أن تغطي كامل DPBS الركيزة خلال حضانة البروتين لضمان التغطية حتى البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة محلول البروتين إلى مزيج DPBS والحل عن طريق الأنابيبمرات عدة تينغ. احتضان المخلوط مع البروتين الركيزة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة 1 تركيزات النهائية لlaminin فبرونيكتين وعادة ما تكون 12 ميكروغرام / مل و 20 ميكروغرام / مل على التوالي. يمكن أن يكون المسمى مع بروتين فلوري أمين صبغ رد الفعل للسماح التصور نمط سهلة. ومع ذلك ، ينبغي أن تكون مختلطة من البروتين المسمى مع بروتين 01:01 غير المسماة ووضع العلامات البروتين يمكن أن تتداخل مع نشاط بيولوجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور فترة الحضانة ، وشطف جيدا مع الركيزة DPBS (4 - 5X) لإزالة البروتين غير منضم ، مع الحرص على عدم جفاف أو جعله ركيزة من خلال واجهة الهواء والماء. بعد يشطف الثلاثة الأولى ، إضافة ما يقرب من 500 ميكرولتر من اكتمال نمو الخلايا وسائل الاعلام للحفاظ على ركيزة الرطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال وسائط النمو المستخدمة لشطف الركيزة مع وسائل الإعلام الجديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفصل عدد الخلايا للطلاء على الركيزة. ويمكن استخدام الخلايا إما فصلها الأولية ، مثل الخلايا العصبية قرن آمون ، أو خطوط الخلية خلده ، مثل CHO - K1 الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة فصل الخلايا على الركيزة. عادة ما تستخدم 30-200 خلايا / مم 2. </li></ol> 5. ممثل النتائج : <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. التخطيطي العام لإعداد الطباعة بصفائح معدة ضوئيا على درجة الماجستير من منقوشة. في هذه العملية ، يتم تنظيف رقاقة السيليكون مع الأسيتون ، ومغطاة مقاومة للضوء ، ويتعرضون لنمط من الفائدة ، ويتم تطوير هذا النمط. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. التخطيطي العام لإعداد ختم PDMS. في هذه العملية ، يتم تغطية الرئيسي منقوشة مع Sylgard (10:1 الراتنج : تصليب) ، دي بالغاز في مجفف فراغ ، الشفاء في الفرن عند 60 درجة مئوية ، وخفض لحجم. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. التخطيطي العام لتنميط الركيزة. في هذه العملية ، هي ركائز الزجاج المطلي مع التيتانيوم (50A) والذهب (150A) باستخدام شعاع الالكترون المبخر ، منقوشة بواسطة hexadecanethiol الطباعة باستخدام microcontact طابع PDMS ، مع ردم thiols غليكول ألكان إنهاؤها ، والمغلفة مع البروتين المسمى fluorescently. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig4.jpg" alt="الشكل 4"/> الشكل 4. منقوشة الرئيسي (A) وختم PDMS (B) التي أعدت باستخدام أساليب وصفها. الحانات هي مقياس 100μm. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig5.jpg" alt="الشكل 5"/> تصور الشكل 5. صواريخ سام منقوشة مع AlexaFluor 647 فبرونيكتين المسمى (أ) و CHO - K1 الحبس الخلية (B). أشرطة النطاق هي 100 ميكرون. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig6.jpg" alt="الشكل 6"/> الشكل 6. منقوشة laminin المصنف مع الخلايا العصبية في قرن آمون الماوس E18 4 أيام في المختبر. يستخدم AlexaFluor 350 مترافق المضادة للأجسام المضادة للlaminin التصور نمط (A) والملون الخلايا العصبية الماوس E18 الحصين مع الأحمر MitoTracker 580 (B). أشرطة النطاق هي 100 ميكرون. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig7.jpg" alt="الشكل 7"/> الشكل 7. المزالق المحتملة في إعداد تصور نمط الركيزة التي AlexaFluor 647 - مترافق فبرونيكتين الامتزاز. (أ) يؤدي الاختلاط غير كافية لامتصاص البروتين متفاوتة. (ب) التطبيق غير المتكافئ للضغط خلال ختم يؤدي إلى نقل باتن جزئية. يمكن (C) الضغط المفرط أثناء ختم تؤدي إلى طابع الانهيار. (D) يمكن أن يؤدي التعرض لسطح منقوشة على واجهة الماء والهواء أثناء الشطف نتيجة امتصاص البروتين في الخلفية. أشرطة النطاق هي 100 ميكرون. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig8.jpg" alt="الشكل 8"/> الشكل 8. الزخرفة الغارقة يمكن أن تنتج أنماط مع الميزات الصغيرة التي يصعب الطباعة عن طريق الطباعة microcontact التقليدية في الهواء. صور (A) و (ب) وتظهر مناطق مختلفة من نفس النمط ، وطبع مع الطابع PDMS نفسه في الهواء (A) أو ماء منزوع الأيونات (B). وتعتبر خطوط الدعم 10μm على نطاق والتي تحيط نمط (المضافة للمساعدة في منع انهيار ختم) في الفقرة (أ) ، ومع ذلك ، فإن ميزات أصغر نقطة كما هو مبين في الفقرة (ب) ألا ينظر هي. هذا يدل على أن الطباعة في الهواء يعمل بشكل جيد للحصول على أكبر الميزات ، ولكن الطباعة في المياه قد تكون ضرورية لأنماط مع أصغر الميزات. أشرطة مقياس هي 20 ميكرومتر. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> دورة </td><td> معدل التسارع (دورة في الدقيقة / ثانية) </td><td> نهائي السرعة (دورة في الدقيقة) </td><td> الوقت (ق) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 500 </td><td> 1000 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 3800 </td><td> 3800 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> الجدول 1.تستغرق دورة البرنامج تدور المستخدمة لإنشاء 4.5 ميكرون طلاء سميكة من AZ9245 على رقاقة السيليكون. لإعداد الطوابع PDMS لتشكيل ركائز منقوشة ، على درجة الماجستير في مقاومة للضوء هي ملفقة الأول (الشكلان 1 و 4A). الرئيسي هو معكوس من الطوابع ، والتي تم إنشاؤها باستخدام إما نظام الطباعة الحجرية والكتابة المباشرة أو اليجنر قناع. عندما يتم استخدام مقاوم الضوء الإيجابي ، مثل AZ9245 ، لإنتاج رئيسية ، يتعرض الرقاقة مقاومة للضوء المغلفة مع نفس النمط الذي سيظهر على الركيزة النهائية. في حين أنه ليس من الممكن دائما ، فقد أفيد أن نسبة الارتفاع المثالي (حجم ميزة لمقاومة سمك) للسادة الختم PDMS هو 1:2. 13 لقد وجدنا أن من نسب 1:40 ممكنة ، تبعا لطبيعة من هذا النمط. وصف AZ9245 رقائق السليكون مغلفة في ظل الظروف هنا تعطي مقاومة للضوء مع سماكة 4.5 ميكرون. لقد وجدنا أنه يمكن استخدام هذا السمك لAZ9245 لإنتاج سادة PDMS مع ميزات تتراوح بين&gt; 100 ميكرون إلى 2 ميكرون. ويلقي الطوابع PDMS من 182 Sylgard (أو Sylgard 184) باستخدام الرئيسي مصنوعة من مقاومة للضوء (الشكل 2). ويمكن استخدام سادة مقاوم الضوء عدة مرات لإنشاء عدة نسخ من الطابع نفسه. بعد تصلب في PDMS ، تتم إزالة الطوابع من سيد باستخدام شفرة حلاقة والطابع الناتجة يمكن تصور تحت المجهر عن طريق وضع ختم الجانب ميزة لأسفل على زجاج ساترة (الشكل 4B) الصحيح في النتائج ختم حاد ، من الواضح أن نمط البروتين يمكن تصور بتطبيق البروتين fluorescently المسمى (أرقام 3 و 5). بدلا من ذلك ، قد يتم استخدام المناعية لتصور نمط البروتين بعد تثبيت الخلية (الشكل 6). يقتصر نمو الخلايا بشكل جيد للنمط البروتين لكل من خطوط الخلايا والخلايا الأولية خلد (الأرقام 5 و 6). في حين أن يتقن هذه التقنية بسهولة ، قد تنشأ مشاكل مشتركة عدة. يمكن للتطبيق من دون خلط البروتين كافية من البروتين الحل يتركز في DPBS يؤدي إلى أنماط متفاوتة من البروتين (7A الشكل). ويمكن أن يؤدي إلى سوء ختم نقل نمط انهيار جزئي أو ختم (الشكل 7B - C). بالإضافة إلى ذلك ، كشف الركيزة المزخرفة التي تحتوي على البروتين كثف إلى الهواء يمكن أن يسبب عرقلة المونولاير المقاومة انخفضت في الخلفية (الشكل 7D). أنماط تتألف من الميزات الصغيرة جدا (&lt;5 ميكرون) ، ونسب عالية وغالبا ما تتطلب استخدام الطباعة microcontact المغمورة. في هذا الماء (3.5b) الإجراء يستخدم كحاجز لمنع hexadecanethiol من إيداع على الركيزة خارج نمط الشكل (8) (14).

<ol>
	<li>Wilbur, J., Kumar, A., Biebuyck, H., Kim, E., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers:+Applications+in+microfabrication.">Microcontact printing of self-assembled monolayers: Applications in microfabrication.</a> Nanotechnology. 7, 452-457 (1996).</li><li>Chang, J., Brewer, G., Wheeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+microstamping+technique+enhances+polylysine+transfer+and+neuronal+cell+patterning.">A modified microstamping technique enhances polylysine transfer and neuronal cell patterning.</a> Biomaterials. 24, 2863-2870 (2003).</li><li>Lange, S., Benes, V., Kern, D., Horber, J., Bernard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+DNA+molecules.">Microcontact printing of DNA molecules.</a> Analytical Chemistry. , 1641-1647 (2004).</li><li>Xia, Y., Mrksich, M., Kim, E., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+octadecylsiloxane+on+the+surface+of+silicon+dioxide+and+its+application+in+microfabrication.">Microcontact printing of octadecylsiloxane on the surface of silicon dioxide and its application in microfabrication.</a> J. Am. Chem. Soc. , 9576-9577 (1995).</li><li>Mrksich, M., Dike, L., Tien, J., Ingber, D., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microcontact+printing+to+pattern+the+attachment+of+mammalian+cells+to+self-assembled+monolayers+of+alkanethiolates+on+transparent+films+of+gold+and+silver.">Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver.</a> Experimental Cell Research. , 305-313 (1997).</li><li>Prime, K. L., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+proteins+onto+surfaces+containing+end-attached+oligo(ethylene+oxide)+-+a+model+system+using+self-assembled+monolayers.">Adsorption of proteins onto surfaces containing end-attached oligo(ethylene oxide) - a model system using self-assembled monolayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 115, 10714-10721 (1993).</li><li>Raghavan, S., Desai, R., Kwon, Y., Mrksich, M., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+Dynamically+Adhesive+Substrates+for+Cell+Migration.">Micropatterned Dynamically Adhesive Substrates for Cell Migration.</a> Langmuir. , 17733-17738 (2010).</li><li>Rogers, J., Bao, Z., Baldwin, K., Dodabalapur, A., Crone, B., Raju, V. R., Kuck, V., Katz, H., Amundson, K., Ewing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-like+electronic+displays:+Large-area+rubber-stamped+plastic+sheets+of+electronics+and+microencapsulated+electrophoretic+inks.">Paper-like electronic displays: Large-area rubber-stamped plastic sheets of electronics and microencapsulated electrophoretic inks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4835-4840 (2001).</li><li>Yanker, D., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+printing+of+trichlorosilanes+on+glass+for+selective+protein+adsorption+and+cell+growth.">Direct printing of trichlorosilanes on glass for selective protein adsorption and cell growth.</a> Molecular Biosystems. 4, 502-504 (2008).</li><li>Johnson, D., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+and+reusing+patterned+self-assembled+monolayers+for+cell+culture.">Recycling and reusing patterned self-assembled monolayers for cell culture.</a> Chemical Communications. , 520-522 (2011).</li><li>Herne, T., Tarlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+DNA+probes+immobilized+on+gold+surfaces.">Characterization of DNA probes immobilized on gold surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. , 8916-8920 (1997).</li><li>Hanson, E., Schwartz, J., Nickel, B., Koch, N., Danisman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bonding+self-assembled,+compact+organophosphonate+monolayers+to+the+native+oxide+surface+of+silicon.">Bonding self-assembled, compact organophosphonate monolayers to the native oxide surface of silicon.</a> J. Am. Chem. Soc. , 16074-16080 (2003).</li><li>Johannes, M., Cole, D., Clark, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscope+based+nanofabrication+of+master+pattern+molds+for+use+in+soft+lithography.">Atomic force microscope based nanofabrication of master pattern molds for use in soft lithography.</a> Applied Physics Letters. , (2007).</li><li>Bessueille, F., Pla-Roca, M., Mills, C. A., Martinez, E., Samitier, J., Errachid, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submerged+microcontact+printing+(S&#x03BC;CP):+An+unconventional+printing+technique+of+thiols+using+high+aspect+ratio,+elastomeric+stamps.">Submerged microcontact printing (S&#x03BC;CP): An unconventional printing technique of thiols using high aspect ratio, elastomeric stamps.</a> Langmuir. , 12060-12063 (2005).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+microcontact+printing+as+a+microlithographic+technique.">Extending microcontact printing as a microlithographic technique.</a> Langmuir. , 2059-2067 (1997).</li><li>Biasco, A., Pisignano, D., Krebs, B., Pompa, P. P., Persano, L., Cingolani, R., Rinaldi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+microcontact-printed+proteins+by+atomic+force+miroscopy+molecular+sizing.">Conformation of microcontact-printed proteins by atomic force miroscopy molecular sizing.</a> Langmuir. , 5154-5158 (2005).</li><li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+proteins+for+cell+biology.">Microcontact printing of proteins for cell biology.</a> J Vis Exp. (22), e1065-e1065 (2008).</li><li>Piner, R., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Dip-pen"+nanolithography.">"Dip-pen" nanolithography.</a> Science. 283, 661-663 (1999).</li><li>Ryan, D., Parviz, B. A., Linder, V., Semetey, V., Sia, S. K., Su, J., Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+multiple+aligned+self-assembled+monolayers+using+light.">Patterning multiple aligned self-assembled monolayers using light.</a> Langmuir. , 9080-9088 (2004).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ويمكن لعدد من القضايا التي تنشأ في إنتاج معدني من أتقن استخدامها لخلق طابع PDMS. ناقص نتائج رقاقة مقاومة المغلفة في أنماط ضبابية وغير واضحة والتعرض المفرط لنتائج رقاقة مقاومة مغلف بالمطاط في ملامح الموسع أو مفقودة. بشكل عام ، والماجستير مع أحجام ميزة كبيرة (&gt; 10 ميكرون) من السهل نسبيا على نمط وتطوير ، في حين سادة مع أصغر الميزات يمكن أن تتطلب التحسين واسعة من المعلمات photopatterning والتنمية (ما وراء المعلمات موصى بها من قبل الشركة المصنعة للمقاومة للضوء). سادة أصعب لإنتاج يجمع بين ميزات كبيرة وصغيرة. تلفيق طابع PDMS من الماجستير واضحة ومباشرة باستخدام الإجراء وصفها في القسم 2. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر لمزيج تماما مكونين من 182 Sylgard. والفشل في تحقيق كامل خلط المكونات يؤدي إلى عدم القدرة على ختم وتتصلب التدمير المحتمل للسيد. بالإضافة إلى ذلك ، يجوز للسيد تتحطم عند فصله عن طابع PDMS إذا تم استخدام القوة الزائدة أو التواء يحدث أثناء فصل. إذا كان سيد لا انقطاع في عملية إزالة الطابع ، قد يكون لا يزال من الممكن استخدام الطوابع بعد التنظيف مع الايثانول. ومع ذلك ، قد يكون هذا الطابع إنتاج أنماط مع مواقع الخلل. أثناء الطباعة باستخدام صواريخ سام microcontact من طابع PDMS هي متعددة وربما يكون من المفيد في كثير من التطبيقات ، يجب اتباع عدد من الخطوات الحاسمة لتحقيق النجاح والحبس بروتين الخلية. للحصول على البروتين الجيد والحبس الخلية ، يجب أن تكون مستعدة ركائز الذهب بواسطة شعاع الإلكترون ترسب ، لأن التبخر الحراري يؤدي إلى السطوح الذهب الخام التي لا تدعم تشكيل أحادي الطبقة المناسبة. علاوة على ذلك ، وجدنا أن الطريقة التي أعد الركيزة الزجاج لترسب التيتانيوم والذهب يؤثر أيضا على نوعية الذهب وركيزة الاستقرار أحادي الطبقة. بينما يمكن تنظيفها ركائز الزجاج لترسب باستخدام مجموعة واسعة من التقنيات ، بما في ذلك الميثانول يغلي &quot;البيرانا&quot; ، 11 و &quot;صقر&quot; حل ، و 12 في أيدينا coverslips أعدتها الأكسدة البلازما هي أعلى بكثير من coverslips تنظيفها باستخدام طرق أخرى. وقد لاحظنا أن وسائل تنظيف المذيبات ، وحامض ، والقائم على قاعدة اعطاء monolayers مع استقرار الزمانية وانخفض عدد متزايد من مواقع الخلل. تقنية ختم الدقيق اللازم لإنتاج البروتين الأمثل والأنماط الخلوية تختلف استنادا إلى حجم وشكل من ميزات لتكون مختومة ونسبة الجانب من الطوابع. عادة ، يجب أن يكون الأمثل للتقنية ختم الدقيق لكل طابع جديد وتقنية ختم تحسن بعد عدة محاكمات. وسوف تطبق الكثير من الضغط خلال ختم تؤدي إلى انهيار الطابع ، والتي هي عرضة للتحدث مع الطوابع التي تحتوي على نسب أكبر الجانب (الشكل 7C). بدلا من ذلك ، تطبيق نتائج الضغط قليلا جدا في نقل نمط جزئية (7B الشكل). ومن الممكن أيضا للاستفادة من تقنية ختم لتغيير طفيف في ملامح هذا النمط. على سبيل المثال ، وجدنا أنه يمكن الميزات زيادة طفيفة في حجم ختم لفترات أطول من الوقت وغيرها وذكرت أنه يمكن تخفيض أبعاد ميزات معينة باستخدام تقنيات الطباعة المغمورة microcontact 15 فقاعات الهواء وغالبا ما تصبح المحاصرين تحت ختم عندما أداء ختم المغمورة ، ولكن هذا الأسلوب قد يعطي أفضل النتائج المرجوة عند الميزات الصغيرة بالتعاون مع الجانب نسب كبيرة. هناك العديد من المزايا لاستخدام الطباعة microcontact بالتزامن مع الكيمياء المونولاير الذاتي تجميعها. عند الطباعة مباشرة على ركائز البروتينات ، وقد تبين أن التغيرات تحدث متعلق بتكوين 16 تعزى إلى الخطوة حيث يتم تجفيفها البروتينات خلال عملية دمغ. ويعتقد أن هذه الخطوة أن تؤدي إلى تجفيف تجميع البروتين وتمسخ ، والذي بدوره يؤثر على وظيفة البروتين. SAM في النظام ، والبروتينات تمتز في الركيزة من محلول مائي مخزنة ، متطابقة إلى الكيفية التي يتم إعدادها عادة ركائز للثقافة الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، الطباعة microcontact من البروتينات لا يحقق الخلية الحبس لفترات طويلة من الزمن ، ويرجع ذلك إلى عدم وجود جزيئات البروتين خلفية مقاومة (17). وفي المقابل ، فإن استخدام جلايكول أحادي الطبقة الخلفية ينص على الحبس ممتازة. (5) في الحالات التي يكون فيها استخدام ركيزة من الذهب هي إما غير ممكن أو غير مرغوب فيه ، يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك مونومرات trichlorosilane للسماح الحبس البروتين والخلايا. 9 في حين أن هناك أساليب الحبس من البروتينات والخلايا التي لا تعتمد على الطباعة microcontact ، وهذه الأساليب تميل الى ان تكون مزيد من العمل المكثف وغير قابلة للإنتاج أعداد كبيرة من ركائز مماثلة المطلوبة عادة للدراسات البيولوجية. 18،19

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> رقاقة السيليكون </td><td> رقاقة إسترد خدمات </td><td></td><td> 2 بوصة </td></tr><tr><td> تدور المغطي / طبق ساخن </td><td> البيرة العلوم </td><td> أوروبا الوسطى والشرقية 200CB سبين ، خبز النظام </td><td></td></tr><tr><td> AZ9245 الواقي الضوئي </td><td> ميس الجبل كيميكال كومباني </td><td> 105880034-1160 </td><td></td></tr><tr><td> مباشرة والكتابة نظام ضوئيه </td><td> ميكروتك SRL </td><td> LW325 LaserWriter النظام </td><td></td></tr><tr><td> قناع أليجنر </td><td> HTG </td><td> 3HR </td><td></td></tr><tr><td> من الالف الى الياء 400K المطور </td><td> ميس الجبل كيميكال كومباني </td><td> 105880018-1160 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard سيليكون إلاستومر 182 كيت </td><td> داو كورننغ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 25 ملم لا. 1 coverslips الزجاجية المستديرة </td><td> VWR </td><td> 16004-310 </td><td></td></tr><tr><td> البلازما المؤكسد </td><td> مساعد مختبر </td><td> فيمتو </td><td></td></tr><tr><td> قطع قميص التيتانيوم </td><td> أدرج </td><td></td><td> 99.95 ٪ نقية </td></tr><tr><td> حبيبات الذهب </td><td> قميص إنكوربوريتد </td><td></td><td> 99.999 ٪ نقية </td></tr><tr><td> شعاع الإلكترون المبخر </td><td> كورت J. Lesker </td><td> PVD 75 ترسب طبقة رقيقة النظام </td><td> مع شعاع الإلكترون التبعي </td></tr><tr><td> Hexadecanethiol </td><td> Aesar ألفا </td><td> A11362 </td><td></td></tr><tr><td> 1 - mercaptoundec - 11 - YL) رباعي (ethyleneglycol) </td><td> سيغما الدريتش </td><td> 674508 </td><td></td></tr><tr><td> الإيثانول </td><td> Pharmco - aaper </td><td> 111000200 </td><td> 200 دليلا ، مطلقة </td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> VWR </td><td> 52858-000 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> VWR </td><td> 4500-434 </td><td> دون الكالسيوم والمغنيسيوم </td></tr><tr><td> أنا الماوس Laminin </td><td> VWR </td><td> 95036-762 </td><td></td></tr><tr><td> بلازما الإنسان [فيبرونكتين] </td><td> Invitrogen </td><td> 33016-015 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 647 حمض الكربوكسيلية ، succinimidyl استر </td><td> Invitrogen </td><td> A - 20006 </td><td></td></tr><tr><td> MitoTracker الأحمر 580 </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 350 حمض الكربوكسيلية ، succinimidyl استر </td><td> Invitrogen </td><td> A - 10168 </td><td></td></tr><tr><td> الأضداد المضادة للlaminin </td><td> فيشر العلمية </td><td> AB2034MI </td><td></td></tr></tbody></table>

creating two-dimensional patterned substrates for protein and cell confinement

الطباعة Microcontact يوفر السريع ، والأسلوب استنساخه للغاية لخلق نمط من ركائز محددة جيدا. 1 بينما يمكن استخدام الطباعة microcontact الطباعة مباشرة على عدد كبير من الجزيئات ، بما في ذلك البروتينات والحمض النووي 2 و 3 و silanes (4) وتشكيل الذات المجمعة monolayers (صواريخ سام) من سلسلة طويلة thiols ألكان على الذهب يوفر وسيلة بسيطة لحصر البروتينات والخلايا التي تحتوي على أنماط محددة لاصقة ومقاومة المناطق. ويمكن استخدام هذا الحبس الاحتياطي للسيطرة على مورفولوجيا الخلايا ومفيدة لدراسة مجموعة متنوعة من الأسئلة في البروتين وبيولوجيا الخلية. هنا ، نحن تصف طريقة عامة لخلق أنماط البروتين واضحة المعالم للدراسات الخلوية 5 تنطوي هذه العملية على ثلاث خطوات : إنتاج رئيسية منقوشة به ضوئيه ، وخلق طابع PDMS ، وmicrocontact الطباعة من الذهب الركيزة المغلفة. منقوشة مرة واحدة ، وهذه ركائز ثقافة الخلية قادرة على حصر البروتينات و / أو الخلايا (الخلايا الأولية أو خطوط الخلية) لهذا النمط. استخدام الكيمياء الذاتي أحادي الطبقة تجميع يسمح لمراقبة دقيقة فوق مناطق منقوشة لاصقة بروتين / خلية والمناطق غير لاصقة ، هذا لا يمكن تحقيقه باستخدام ختم المباشر البروتين. Hexadecanethiol ، وسلسلة طويلة ثيول ألكان المستخدمة في الطباعة microcontact الخطوة ، وتنتج سطح مسعور أن تمتز بسهولة البروتين من الحل. وجلايكول منتهية ثيول ، وتستخدم لردم المناطق غير المطبوعة من الركيزة ، ويخلق أحادي الطبقة التي هي مقاومة للامتصاص البروتين وبالتالي نمو الخلية. 6 تنتج هذه مونومرات ثيول monolayers منظم جدا أن تحدد بدقة مناطق الركيزة التي يمكن أن تدعم الامتزاز البروتين ونمو الخلية. ونتيجة لذلك ، وهذه الركائز هي مفيدة لطائفة واسعة من التطبيقات من دراسة السلوك بين الخلايا من 7 إلى خلق الالكترونيات الدقيقة 8 بينما تم استخدام أنواع أخرى من الكيمياء المونولاير للدراسات ثقافة الخلية ، بما في ذلك العمل من مجموعتنا trichlorosilanes به لخلق أنماط مباشرة على ركائز الزجاج ، 9 monolayers منقوشة تشكلت من thiols ألكان على الذهب هي على التوالي إلى الأمام للاستعداد. وعلاوة على ذلك ، وتستخدم لإعداد مونومرات المونولاير متاحة تجاريا ، ومستقرة ، ولا تتطلب معالجة أو تخزين تحت جو خامل. يمكن أن يعد من ركائز منقوشة thiols ألكان كما يمكن إعادة تدويرها وإعادة استخدامها مرات عدة ، والحفاظ على الحبس الخلية. 10

Watch this Scientific Journal Video about Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement at JoVE.com

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

الذات تجميعها monolayers (صواريخ سام) التي تشكلت من سلسلة طويلة thiols ألكان على الذهب توفير ركائز محددة جيدا لتشكيل أنماط البروتين والحبس الخلية. الطباعة Microcontact من hexadecanethiol باستخدام (PDMS) ختم polydimethylsiloxane تليها الردم مع غليكول منتهية ألكان ثيول مونومر تنتج نمطا حيث البروتين وخلايا كثف فقط لمنطقة hexadecanethiol ختمها.

إنشاء ثنائي الأبعاد ركائز منقوشة على الحبس البروتين والخلايا

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

creating-two-dimensional-patterned-substrates-for-protein-cell

Google

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K Views.  Washington University in St. Louis. الذات تجميعها monolayers (صواريخ سام) التي تشكلت من سلسلة طويلة thiols ألكان على الذهب توفير ركائز محددة جيدا لتشكيل أنماط البروتين والحبس الخلية. الطباعة Microcontact من hexadecanethiol باستخدام (PDMS) ختم polydimethylsiloxane تليها الردم مع غليكول منتهية ألكان ثيول مونومر تنتج نمطا حيث البروت...

Video: Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor microfabrication.1-10 Recently, thermal inkjet printing has also been used for gene transfection.8,9 The thermal inkjet printing process was shown to temporarily disrupt the cell membranes without affecting cell viability. The transient pores in the membrane can be used to introduce molecules, which would otherwise be too large to pass through the membrane, into the cell cytoplasm.8,9,11
The application being demonstrated here is the use of thermal inkjet printing for the incorporation of fluorescently labeled g-actin monomers into cells. The advantage of using thermal ink-jet printing to inject molecules into cells is that the technique is relatively benign to cells.8, 12 Cell viability after printing has been shown to be similar to standard cell plating methods1,8. In addition, inkjet printing can process thousands of cells in minutes, which is much faster than manual microinjection. The pores created by printing have been shown to close within about two hours. However, there is a limit to the size of the pore created (~10 nm) with this printing technique, which limits the technique to injecting cells with small proteins and/or particles. 8,9,11
A standard HP DeskJet 500 printer was modified to allow for cell printing.3, 5, 8 The cover of the printer was removed and the paper feed mechanism was bypassed using a mechanical lever. A stage was created to allow for placement of microscope slides and coverslips directly under the print head. Ink cartridges were opened, the ink was removed and they were cleaned prior to use with cells. The printing pattern was created using standard drawing software, which then controlled the printer through a simple print command. 3T3 fibroblasts were grown to confluence, trypsinized, and then resuspended into phosphate buffered saline with soluble fluorescently labeled g-actin monomers. The cell suspension was pipetted into the ink cartridge and lines of cells were printed onto glass microscope cover slips. The live cells were imaged using fluorescence microscopy and actin was found throughout the cytoplasm. Incorporation of fluorescent actin into the cell allows for imaging of short-time cytoskeletal dynamics and is useful for a wide range of applications.13-15

A description of the methods used to convert an HP DeskJet 500 printer into a bioprinter. The printer is capable of processing living cells, which causes transient pores in the membrane. These pores can be utilized to incorporate small molecules, including fluorescent G-actin, into the printed cells.

خلق عابر المسامات غشاء الخلية باستخدام طابعة نافثة للحبر القياسية

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

إنشاء تدرجات لاصق وقابل للذوبان للهجرة الخليوي مع التصوير مضان المجهري

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

الزخرفة الخلية على Photolithographically معرفة Parylene-C: شافي<sub&gt; 2</sub&gt; ركائز

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

طلب خلايا واحدة والأجنة واحدة في 3D الحبس: جهاز جديد لفحص المحتوى العالي

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

مضان الانتعاش بعد دمج قطرات لقياس انتشار ثنائي الأبعاد من الفوسفوليبيدية واحد رقائق

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

توسيع Nanopatterned ركائز باستخدام تقنية غرزة لNanotopographical التحوير سلوك الخلية

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

تقييم انتشار Keratinocyte على عمليات ثنائية وثلاثية الأبعاد في النوع الأول من ركائز الكولاجين

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

زخرفه هندسه مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية علي ركائز متوافقة للتحكم في ميكانيكا مستوي الانسجه

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

إعداد البروتين إنتاج الخلايا الاصطناعية باستخدام مقتطفات البكتيريا الحرة الخلية، Liposomes ونقل المستحلب

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

التحليل المكاني الزماني الآلي ثنائي الأبعاد لمجسات FRET أحادية الجزيء المتنقلة

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...