עבודה זו מומנה על ידי המעבדה הלאומית לורנס ליברמור LDRD 18-ERD-062 (ל- C.R). תודה לג'ון מושלר על תרומתו האדיבה לתאי DgKO ו- DgKI. תודה לצוות המעבדה למיקרוסקופ אלקטרונים באוניברסיטת קליפורניה בברקלי על ייעוץ וסיוע בהכנת דגימות מיקרוסקופיית אלקטרונים ואיסוף נתונים.

1. הפשרה ו aliquot laminin-111
הערה: למינין-111 מטוהר זמין באופן מסחרי (בדרך כלל מטוהר ממטריצת EHS שנמכרת כמטריג'ל), אך לא כל המקורות מספקים חלבון שלם ולא מתפרק.
<ol><li>ודא כי Ln1 אינו פגום על ידי מיקור Ln1 והפעלת גודל לא כולל כרומטוגרפיה26 או אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד26. ל-Ln1 מפורק צריכות להיות רצועות ב-337 kDa, 197 kDa ו-177 kDa, ול-Ln1 מקורי צריכה להיות להקה אחת ב-711 kDa.</li>
	<li>הפשירו Ln1 על קרח במקרר למשך הלילה, והכניסו אותו לצינורות מיקרו-צנטריפוגות דלות חלבון (בדרך כלל aliquot ב-100 מיקרוגרם לשפופרת עבור שכבות-על של תרבית, או 10 מיקרוגרם עבור ציפויים) באמצעות קצוות קשירת חלבון נמוכים וטכניקה סטרילית27. להקפיא aliquots ולאחסן ב -80 °C.</li>
</ol>2. פילמור למינין באמצעות מאגרי pH נמוכים

<ol><li>צור חיץ פילמור polyLM: שקול וערבב 1 mM CaCl2 ו 20 mM נתרן אצטט במים טהורים במיוחד. לאחר מכן להתאים את ה- pH ל 4.0, באמצעות HCl או חומצה אצטית. מסננים סטריליים דרך מסנן 0.2 מיקרומטר, ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C.</li>
	<li>צור חיץ פילמור בקרה: ערבב 1 mM CalCl2 ו- 20 mM Tris וכוונן את ה- pH ל- 7.0, באמצעות 10 N HCl או 12 N NaOH לפי הצורך. מסננים סטריליים דרך מסנן 0.2 מיקרומטר, ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.</li>
	<li>הפשירו את המספר הדרוש של אליציטוטים Ln-1 במקרר למשך הלילה.</li>
	<li>באמצעות טכניקת תרבית תאים סטרילית, הוסף את המאגר המתאים (או חיץ פילמור פוליLM משלב 2.1 או חיץ פילמור בקרה משלב 2.2) לאליציטוטים למינין בריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל (כלומר הוסף 0.5 מ"ל ל 50 מיקרוגרם aliquots) וערבב בעדינות על ידי pipetting.</li>
	<li>אם אתם משתמשים בלמינין עם תווית פלואורסצנטית להמחשה, יש ליצור מחדש ולהוסיף ביחס של 1:50 wt/wt (לדוגמה, 2 מיקרוגרם/100 מיקרוגרם) ולערבב בעדינות באמצעות פיפט. הערה: אם אתה משתמש בלמינינים כמצע עבור קובץ מצורף לתא, בצע את שלבים 2.6-2.8:</li>
	<li>מיד לאחר דילול בחיץ מתאים, מעבירים למינינים לתרבית פלסטיק או כלי זכוכית ודגרים לילה באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שימו לב שבעת ציפוי כיסויים, הוסיפו נפח גדול מספיק כדי ליצור טיפה מאוזנת (בדרך כלל, השתמשו ב-50 מיקרוליטר לכיסוי עגול של 13 מ"מ), ושמרו בתא לח למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C.</li>
	<li>בטכניקה סטרילית27, יש לשטוף במי מלח חוצצים פוספט 1x (PBS).</li>
	<li>מוציאים את הנוזל בזהירות. אין לאפשר למשטח להיות יבש לחלוטין. הערה: אם אתה משתמש בלמינינים לכיסוי תאים להשראת חלבון חלב, בצע את השלבים 2.9-2.12:</li>
	<li>תרבית תאי אפיתל החלב. תרבית תאי דיסטרוגליקן מסוג MepG (DgKI) או תאי נוקאאוט דיסטרוגליקן MepG (DgKO) בתאי DMEM-F12 בתוספת 2% FBS, 0.01 מ"ג/מ"ל אינסולין, 0.005 מיקרוגרם/מ"ל EGF, 0.05 מ"ג/מ"ל גנטמיצין ו-0.05 גרם/מ"ל נורמוצין.</li>
	<li>זרע DgKO ו DgKI תאים לגירוי למינין ב 10,500 תאים / ס"מ2 בצלחות באר או לכסות כלים תחתונים</li>
	<li>לדגור על למינינים מדוללים באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה polyLM aliquots ב 2,000 x גרם במשך 20 דקות, אבל צנטריפוגה LM ב pH ניטרלי ב 20,000 x גרם במשך 20 דקות בשל גודל קטן יותר של ישויות חלבון צורך מהירויות גבוהות יותר לאסוף ביעילות.</li>
	<li>באמצעות טכניקה סטרילית27, להסיר את supernatant בעדינות, ולהשהות מחדש בנפח מתאים של אמצעי השראה של DMEM-F12 בתוספת 3 מיקרוגרם / מ"ל פרולקטין, 2.8 מיקרומטר הידרוקורטיזון, ו 5 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין</li>
	<li>העבר למינין בתווך תרבית התא באופן מיידי כדי לעורר תאים. גירינו בהצלחה תאים עם 50-800 מיקרוגרם/מ"ל Ln1</li>
</ol>3. פילמור למינין באמצעות גליקופרוטאינים מבודדים
<ol><li>הפשירו בעדינות nidogen-1 ו-Ln1 רקומביננטיים על קרח במקרר למשך הלילה.</li>
	<li>ערבבו את Ln1 עם nidogen-1 ביחס של 1:1 wt/wt בתווך תרבית תאים תוך שימוש בקצוות ובצינורות דלי קשירת חלבונים ובטכניקה סטרילית. השתמש ב- Ln1 טהור במדיום תרבית תאים כבקרה.</li>
	<li>אם אתה משתמש בלמינין מתויג פלואורסצנטית לתצוגה חזותית, צור מחדש והוסף ביחס של 1:50 wt/wt (לדוגמה, 2 מיקרוגרם/100 מיקרוגרם). מערבבים בעדינות על ידי פיפט.</li>
	<li>לדגור על Ln1-nidogen או לשלוט Ln1 באינקובטור תרבית תאים ב 37 ° C במשך 30 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה Ln1-nidogen קופולימרים ב 2,000 x גרם במשך 30 דקות ואת הבקרה Ln1 ב 20,000 x גרם במשך 30 דקות.</li>
	<li>מסירים בעדינות את הסופרנאטנט ומשהים מחדש בתווך תרבית התאים לריכוז סופי של 100-800 מיקרוגרם סה"כ חלבון/מ"ל.</li>
	<li>יש להשתמש מיד כדי לעורר תאים, או להעביר לכיסויים ולאפשר להיצמד למשך הלילה לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטורים של תרביות תאים לחות.</li>
	<li>יש להסיר את מדיום התרבית מהכיסויים, לשטוף את הכיסויים עם 1x PBS, ולאחר מכן לתקן עם 10% פורמלין (כלומר, 4% פורמלדהיד ב-PBS) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
</ol>4. פילמור למינין באמצעות תאים המבטאים דיסטרוגליקן
<ol><li>תרבית תאי אפיתל החלב. תרבית תאי דיסטרוגליקן מסוג MepG (DgKI) או תאי נוקאאוט דיסטרוגליקן MepG (DgKO) בתאי DMEM-F12 בתוספת 2% FBS, 0.01 מ"ג/מ"ל אינסולין, 0.005 מיקרוגרם/מ"ל EGF, 0.05 מ"ג/מ"ל גנטמיצין ו-0.05 גרם/מ"ל נורמוצין.</li>
	<li>תאי DgKI זרעים ב-5,000 תאים לסמ"ק2, ותאי DgKO זרעים ב-8,000 תאים לסמ"ק2 עקב הבדלים בקצב הצמיחה. תרבית ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטורים לחים עם שינויי מדיה כל 2-3 ימים ומעברים כל 4-5 ימים באמצעות טכניקה סטרילית קפדנית. ספור תאים בזהירות עם המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי27 כדי להבטיח קצבי גדילה מתאימים.</li>
	<li>תאי זרעים לגירוי למינין ב 10,500 תאים / ס"מ2 בצלחות באר או לכסות כלים תחתונים ותרבית במשך יומיים, באמצעות תאי DgKI כדי לייצר תאי Ln1 ו- DgKO פרקטליים כבקרות שליליות. יש להפשיר את Ln-1 בעדינות למשך הלילה על קרח במקרר, ולאחר מכן לערבב עם מצע אינדוקציה של DMEM-F12 בתוספת פרולקטין של 3 מק"ג/מ"ל, הידרוקורטיזון של 2.8 מיקרומטר ואינסולין של 5 מק"ג/מ"ל. עבור צלחת 35 מ"מ, השתמש 1 מ"ל של מדיה אינדוקציה עם 50-800 מיקרוגרם של Ln1.</li>
	<li>אם אתם משתמשים ב-Ln1 פלואורסצנטי, ערבבו ביחס של 50:1 wt/wt.</li>
	<li>יש להסיר מדיה מהתאים, ולכסות בלמינין ובאמצעי אינדוקציה של DMEM-F12 בתוספת פרולקטין של 3 מיקרוגרם/מ"ל, הידרוקורטיזון של 2.8 מיקרומטר ואינסולין של 5 מק"ג/מ"ל</li>
	<li>תאים תרבית במשך 2 ימים, ולאחר מכן לתקן עם 10% פורמלין.</li>
</ol>5. אפיון מיקרו-מבנה למינין באמצעות מיקרוסקופ אופטי
<ol><li>אספו דגימות קבועות ושטפו 3 פעמים עם 1x PBS בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.</li>
	<li>יש לחסום ולחדור דגימות ב-PBS 1x עם 0.5% Triton X-100, אלבומין בסרום 3% בקר, 10% סרום עיזים ומקטע נוגדנים חוסם נגד עכבר 40 מיקרוגרם/מ"ל למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בתא לח. הערה: Triton X-100 מסוכן. יש לטפל עם כפפות והגנה על העיניים ולהיפטר בהתאם.</li>
	<li>יש לערבב נוגדן אנטי-למינין בדילול של 1:100 עם 1x PBS עם 0.5% Triton X-100 ו-3% BSA ולהוסיף לדגימות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב-4°C בתא לח (בדרך כלל להשתמש בקופסאות קצה עם מגבון מעבדה רטוב בתחתית).</li>
	<li>יש להסיר את הנוגדן הראשוני ולשטוף 3 פעמים עם PBS אחד עם 0.5% Triton X-100 ו-3% BSA.</li>
	<li>יש להוסיף נוגדן משני מתאים בדילול של 1:500 לדגימות ב-1x PBS עם 0.5% Triton X-100 ו-3% BSA ולדגור בטמפרטורת החדר בחושך בתא לח.</li>
	<li>יש להסיר נוגדנים משניים ולשטוף 3 פעמים עם 1x PBS עם 0.5% Triton X-100 ו-3% BSA.</li>
	<li>עבור דגימות המכילות תאים, יש להוסיף פאלואידין 6 מיקרומטר למשך 45 דקות, לאחר מכן 3 שטיפות עם PBS עם 0.5% Triton X-100 ו-3% BSA, ולאחר מכן 3 שטיפות עם PBS. לאחר מכן יש להכתים עם 0.1 מיקרוגרם/מ"ל DAPI ב-PBS למשך 5 דקות.</li>
	<li>הר דוגמאות במידת הצורך.</li>
	<li>מבנה תמונה ln-1 באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה. השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר המצויד במטרות טבילה (תוכנית טבילה במים Apochromat 40X/1.1NA או טבילת שמן Plan Apochromat 63X/1.4NA).</li>
</ol>6. אפיון מבני למינין באמצעות ממד ספירת קופסאות
<ol><li>נתח תכונות פרקטליות באמצעות אלגוריתמים של ממדי ספירת קופסאות הזמינים בארגזי הכלים של Matlab או ב- ImageJ. שיטות אלה מציבות תמונות סף של למינין והתוויית יומן בהתוויית יומן את מספר התיבות המכילות Ln1 בהשוואה לגודל התיבות. שיפוע היחסים בין פרמטרים אלה הוא ממד ספירת הקופסאות: גאומטריות לא פרקטליות יהיו בעלות ממד של 0, 1 או 2, בעוד שגיאומטריות פרקטליות יהיו בעלות ממד לא שלם28. הערה: ל-Ln1 המחובר לתאי DgKI המטופלים בחומצה, מטופלים בגליקופרוטאין ומחוברים לתאי DgKI יש ממד פרקטלי של ~1.7, בעוד של-Ln1 הבקרה יש ממד פרקטלי של 2.0.</li>
</ol>7. אפיון מבני למינין באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים
<ol><li>להשהות למינינים במדיה תרבית תאים ולאפשר לספוח פרוסות סיליקה במשך 90 דקות בסביבה לחה 37 ° C.</li>
	<li>תקן מטריצות ב 2.5% גלוטראלדהיד ב 0.1 M נתרן cacodylate חיץ ב pH 7.2. הערה: גלוטראלדהיד הוא מסוכן ויש לטפל בו במכסה אדים עם כפפות והגנה על העיניים ולהשליך אותו כפסולת מסוכנת.</li>
	<li>מטריצות Postfix ב 1% osmium tetroxide ב 0.1 M נתרן cacodylate חיץ ב pH 7.2. הערה: אוסמיום טטרוקסיד הוא מסוכן ויש לטפל בו במכסה אדים עם כפפות והגנה על העיניים ולסלק אותו כראוי. Cacodylate הוא מסוכן ויש לטפל בו במכסה מנוע עם כפפות והגנה על העיניים ולהיפטר ממנו כראוי.</li>
	<li>יש לשטוף 3 פעמים במאגר נתרן קקודילט ב-pH 7.2.</li>
	<li>להתייבש עם ריכוזים הולכים וגדלים של אתנול.</li>
	<li>מפזרים מטריצות מעיל עם שכבה דקה של זהב.</li>
	<li>תמונה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+control+of+invasive+tumor+cell+behavior+by+extracellular+matrix+microarchitecture.">Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture.</a> Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening+and+unfolding+of+early+deposited-fibronectin+increase+proangiogenic+factor+secretion+by+breast+cancer-associated+stromal+cells.">Stiffening and unfolding of early deposited-fibronectin increase proangiogenic factor secretion by breast cancer-associated stromal cells.</a> Biomaterials. 54, 63-71 (2015).</li><li>Bruekers, S. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin-fiber+architecture+influences+cell+spreading+and+differentiation.">Fibrin-fiber architecture influences cell spreading and differentiation.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 10 (5), 495-504 (2016).</li><li>Yurchenco, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+Activities+of+Laminins+that+Drive+Basement+Membrane+Assembly+and+Function.">Integrating Activities of Laminins that Drive Basement Membrane Assembly and Function.</a> Curr Top Membr. 76, 1-30 (2015).</li><li>Colognato, H., Winkelmann, D. A., Yurchenco, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+Polymerization+Induces+a+Receptor-Cytoskeleton+Network.">Laminin Polymerization Induces a Receptor-Cytoskeleton Network.</a> The Journal of Cell Biology. 145 (3), 619-631 (1999).</li><li>Powell, S. K., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+laminins+and+their+cellular+receptors.">Neuronal laminins and their cellular receptors.</a> International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 29 (3), 401-414 (1997).</li><li>Li, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+a+reconstituted+basement+membrane+and+its+components+on+casein+gene+expression+and+secretion+in+mouse+mammary+epithelial+cells.">Influence of a reconstituted basement membrane and its components on casein gene expression and secretion in mouse mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (1), 136-140 (1987).</li><li>Fiore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-111+and+the+Level+of+Nuclear+Actin+Regulate+Epithelial+Quiescence+via+Exportin-6.">Laminin-111 and the Level of Nuclear Actin Regulate Epithelial Quiescence via Exportin-6.</a> Cell Rep. 19 (10), 2102-2115 (2017).</li><li>Inman, J. L., Robertson, C., Mott, J. D., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+gland+development:+cell+fate+specification,+stem+cells+and+the+microenvironment.">Mammary gland development: cell fate specification, stem cells and the microenvironment.</a> Development. 142 (6), 1028-1042 (2015).</li><li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).</li><li>Furuta, S., Ren, G., Mao, J. -. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+signals+initiate+the+reciprocal+loop+that+informs+breast-specific+gene+expression+and+homeostasis+by+activating+NO,+p53+and+microRNAs.">Laminin signals initiate the reciprocal loop that informs breast-specific gene expression and homeostasis by activating NO, p53 and microRNAs.</a> eLife. 7, 26148 (2018).</li><li>Brown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophic+phenotype+induced+in+vitro+by+antibody+blockade+of+muscle+alpha-dystroglycan-laminin+interaction.">Dystrophic phenotype induced in vitro by antibody blockade of muscle alpha-dystroglycan-laminin interaction.</a> Journal of Cell Science. 112 (2), 209 (1999).</li><li>Calof, A. L., Campanero, M. R., O'Rear, J. J., Yurchenco, P. D., Landert, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain-specific+activation+of+neuronal+migration+and+neurite+outgrowth-promoting+activities+of+laminin.">Domain-specific activation of neuronal migration and neurite outgrowth-promoting activities of laminin.</a> Neuron. 13 (1), 117-130 (1994).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-sulfatide+binding+initiates+basement+membrane+assembly+and+enables+receptor+signaling+in+Schwann+cells+and+fibroblasts.">Laminin-sulfatide binding initiates basement membrane assembly and enables receptor signaling in Schwann cells and fibroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 169 (1), 179-189 (2005).</li><li>Sonnenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+recognition+of+different+cell-binding+fragments+of+laminin+(P1,+E3,+E8)+and+evidence+that+alpha+6+beta+1+but+not+alpha+6+beta+4+functions+as+a+major+receptor+for+fragment+E8.">Integrin recognition of different cell-binding fragments of laminin (P1, E3, E8) and evidence that alpha 6 beta 1 but not alpha 6 beta 4 functions as a major receptor for fragment E8.</a> The Journal of Cell Biology. 110 (6), 2145-2155 (1990).</li><li>Sorokin, L., Sonnenberg, A., Aumailley, M., Timpl, R., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+the+laminin+E8+cell-binding+site+by+an+integrin+possessing+the+alpha+6+subunit+is+essential+for+epithelial+polarization+in+developing+kidney+tubules.">Recognition of the laminin E8 cell-binding site by an integrin possessing the alpha 6 subunit is essential for epithelial polarization in developing kidney tubules.</a> The Journal of Cell Biology. 111 (3), 1265-1273 (1990).</li><li>Horejs, C. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologically-active+laminin-111+fragment+that+modulates+the+epithelial-to-mesenchymal+transition+in+embryonic+stem+cells.">Biologically-active laminin-111 fragment that modulates the epithelial-to-mesenchymal transition in embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5908-5913 (2014).</li><li>Hochman-Mendez, C., Cantini, M., Moratal, D., Salmeron-Sanchez, M., Coelho-Sampaio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fractal+Nature+for+Polymerized+Laminin.">A Fractal Nature for Polymerized Laminin.</a> PLOS ONE. 9 (10), 109388 (2014).</li><li>Kent, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microstructure+of+laminin-111+compensates+for+dystroglycan+loss+in+mammary+epithelial+cells+in+downstream+expression+of+milk+proteins.">The microstructure of laminin-111 compensates for dystroglycan loss in mammary epithelial cells in downstream expression of milk proteins.</a> Biomaterials. 218, 119337 (2019).</li><li>Weir, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystroglycan+loss+disrupts+polarity+and+beta-casein+induction+in+mammary+epithelial+cells+by+perturbing+laminin+anchoring.">Dystroglycan loss disrupts polarity and beta-casein induction in mammary epithelial cells by perturbing laminin anchoring.</a> Journal of Cell Science. 119, 4047-4058 (2006).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Palmero, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+follicular+thyroid+cell+line+PCCL3+responds+differently+to+laminin+and+to+polylaminin,+a+polymer+of+laminin+assembled+in+acidic+pH.">The follicular thyroid cell line PCCL3 responds differently to laminin and to polylaminin, a polymer of laminin assembled in acidic pH.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 376 (1), 12-22 (2013).</li><li>Hochman-Mendez, C., Lacerda de Menezes, J. R., Sholl-Franco, A., Coelho-Sampaio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polylaminin+recognition+by+retinal+cells.">Polylaminin recognition by retinal cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 92 (1), 24-34 (2014).</li><li>Leal-Lopes, C., Grazioli, G., Mares-Guia, T. R., Coelho-Sampaio, T., Sogayar, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerized+laminin+incorporation+into+alginate-based+microcapsules+reduces+pericapsular+overgrowth+and+inflammation.">Polymerized laminin incorporation into alginate-based microcapsules reduces pericapsular overgrowth and inflammation.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 13 (10), 1912-1922 (2019).</li><li>Paccola Mesquita, F. C., Hochman-Mendez, C., Morrissey, J., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+as+a+Potent+Substrate+for+Large-Scale+Expansion+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Closed+Cell+Expansion+System.">Laminin as a Potent Substrate for Large-Scale Expansion of Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Closed Cell Expansion System.</a> Stem Cells International. 2019, 9 (2019).</li><li>Walker, J. M., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Protein Protocols Handbook. , 61-67 (2002).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques. 7th edition. , (2016).</li><li>Mandelbrot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Fractal Geometry of Nature. , (1982).</li><li>Schittny, J. C., Yurchenco, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+short+arm+domains+of+basement+membrane+laminin+are+critical+for+its+self-assembly.">Terminal short arm domains of basement membrane laminin are critical for its self-assembly.</a> Journal of Cell Biology. 110 (3), 825-832 (1990).</li><li>Schuger, L., Yurchenco, P., Relan, N. K., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+fragment+E4+inhibition+studies:+basement+membrane+assembly+and+embryonic+lung+epithelial+cell+polarization+requires+laminin+polymerization.">Laminin fragment E4 inhibition studies: basement membrane assembly and embryonic lung epithelial cell polarization requires laminin polymerization.</a> International Journal of Developmental Biology. 42 (2), 217-220 (1998).</li><li>Colognato, H., Yurchenco, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form+and+function:+the+laminin+family+of+heterotrimers.">Form and function: the laminin family of heterotrimers.</a> Developmental Dynamics. 218 (2), 213-234 (2000).</li><li>Kabaeva, Z., Meekhof, K. E., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcolemma+instability+during+mechanical+activity+in+Large+myd+cardiac+myocytes+with+loss+of+dystroglycan+extracellular+matrix+receptor+function.">Sarcolemma instability during mechanical activity in Large myd cardiac myocytes with loss of dystroglycan extracellular matrix receptor function.</a> Human Molecular Genetics. 20 (17), 3346-3355 (2011).</li></ol>

עבודה זו בוצעה בחסות משרד האנרגיה של ארצות הברית על ידי המעבדה הלאומית לורנס ליברמור תחת חוזה DE-AC52-07NA27344. שחרור IM LLNL-JRNL-799443.

למינינים מייצגים מרכיב מרכזי של ECM במערכות אפיתל, שרירים ואיברים עצביים, והוכחו במבחנה כממלאים תפקידים חיוניים בוויסות ההתמיינות התפקודית של תאים. עדויות הולכות ומצטברות מצביעות על כך שמבנה הלמינין המוצג לתאים מווסת את האיתות שלו ואת פנוטיפ התא15,16 המתקבל ?...

שלא כמו גורמי גדילה או ציטוקינים, חלבוני מטריצה חוץ-תאיים (ECM) יכולים להתאסף לרשתות מבניות. מכיוון שתפקוד לקוי של ECM הוא מרכיב מרכזי במצבי מחלה רבים, המנגנונים שבאמצעותם תאים חשים ומתמרים אותות מהרכב ECM, מיקרו-מבנה וביומכניקה הם מטרות אטרקטיביות לפיתוח טיפולי. עדויות הולכות ומצטברות מצביעות על כך שהמיקרו-מבנה של רשתות אלה ממלא תפקיד מרכזי באופן שבו חלבונים אלה מאותתים לתאים. עד כה, הקשר הזה בין מיקרו-מבנה ECM לבין תפקוד התאים הוכח עבור קולגן I1, פיברונקטין2 ופיברין3.
Laminin-111 (Ln1) הוא חלבון טרימרי בצורת צלב המהווה מרכיב מבני מרכזי במטריצה החוץ תאית שבאה במגע עם תאי אפיתל4, תאי שריר5 ותאים עצביים6. בבלוטת החלב, Ln1 הכרחי להתמיינות תפקודית של תאי אפיתל בלוטת החלב לתאים מייצרי חלב 7,8,9, ו- Ln1 חיוני להשראת היפוך הגידול10,11. Ln1 ולמינינים אחרים נחוצים להתפתחות רשתות אקטין קליפת המוח וארגון סרקולמה בשריר12,13, ולנדידת תאים עצביים וצמיחת נוירונים13 . לפיכך, הבנת המנגנונים שבאמצעותם למינין מאותת לתאים היא תחום מחקר פעיל.
Ln1 מכיל תחומי הדבקה מרובים עבור מגוון רחב של קולטנים, כולל אינטגרינים, סינדקנים, דיסטרופיקן, LBP-110 ו-LamR (איור 1A)4,14. מקטע E8, המכיל את התחומים הכדוריים c-terminus של למינין α1, הכרחי לקשירת דיסטרופיקן ואינטגרינים α6β1 ו- α3β115, והוא הכרחי להתמיינות פונקציונלית של תאי אפיתל 15,16. לעומת זאת, הזרועות הקצרות מראות פעילות ביולוגית שונה17, כלומר זמינות לזיהוי תחומי Ln1 שונים אלה לאחר היווצרות הרשת עשויה לשנות את התנהגות התא.
לאחרונה הראינו כי Ln1 המסודר ברשת פולימרית מציג תכונות פרקטליות (כלומר, מבנה הדומה לעצמו על פני סקאלות אורך מרובות)18. רשתות פרקטליות מאותתות באופן שונה לתאי אפיתל בהשוואה ל- Ln1, אשר חסר סידור זה19. רשת פרקטלית זו מצביעה על מבנה הרכבה מסוים, שבו הזרוע הארוכה חשופה באופן מועדף לתאים18. כתוצאה מתצוגת זרועות ארוכות ושונה זו, תאי אפיתל עוברים התמיינות תפקודית לתאים מייצרי חלב עם צמתים הדוקים מאורגנים היטב ודיכוי סיבי עקה אקטין19.
אנו מתארים 3 שיטות ליצירת רשתות Ln1 מאינטראקציות קשירת זרוע קצרה-זרוע קצרה, אשר מראות תצוגה גבוהה של הזרוע הארוכה Ln1: 1) על ידי הרכבה ללא תאים עם מאגרים חומציים, 2) על ידי דגירה משותפת עם גליקופרוטאינים, או 3) על ידי אינטראקציה עם דיסטרופיקן פני התא. שלוש שיטות אלה מייצרות מיקרו-מבנים דומים של למינינים באמצעות שלושה מנגנונים שונים מאוד, המאפשרים גמישות בתכנון הניסוי. עבודות קודמות מצביעות על כך ששלוש שיטות אלה יכולות לייצג חוסן ביולוגי: באפיתל של בלוטת החלב, דיסטרוגליקן על פני התא, גליקופרוטאינים, או למינין במבנה מלאכותי יכולים לגרום להתמיינות תפקודית19. לפיכך, החוקרים יכולים לבחור בין שיטות אלה בהתבסס על נושא המחקר: תאים המבטאים דיסטרוגליקן אינם מראים רגישות למיקרו-מבנה Ln-1, שכן דיסטרופיקן בקרום התא גורם לפילמור נכון לרשת פרקטלית19,20. Matrigel, תערובת של למינינים וגליקופרוטאינים21, מייצג את המקור החסכוני ביותר של Ln-1, ומציע את המיקרו-מבנה הדרוש כדי לגרום לתאי חלב נוקאאוט דיסטרופיקניים להתמיין20, אך מכיל תערובת מורכבת של חלבונים עם שונות רבה להרבה. PolyLM מייצגת את המערכת הרדוקציוניסטית הנקייה ביותר המספקת פונקציה זו, אך בעלות מוגברת וביעילות נמוכה יותר להשראת התמיינות תאי חלב בהשוואה למטריג'ל19.
לשלוש שיטות אלה מבנה רשת פרקטלי האופייני לצבירה מוגבלת בדיפוזיה18,19, והן מראות פעילות ביולוגית שונה בהשוואה ללמינין מצטבר במערכות ניסוי מרובות 22,23,24,25. מחקרים עתידיים המשתמשים בשיטות אלה יוכלו לזהות את הקולטנים והאיתות הדרושים להתמיינות אפיתל ולקבוע לשחזר אינטראקציות נורמליות בין מטריצת תאים בתאים במיקרו-סביבות חריגות20, כגון גידולים.

<table><tbody><tr><td>10% formalin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Laminin primary antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody</td><td>Thermo</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901 or similar</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Incubator</td><td>Thermo</td><td>Heracell 150 or similar</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge for microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>5418 or similar</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710 or equivalent</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Thermo</td><td>25CIR-1 or similar</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red</td><td>Thermo</td><td>11330107</td><td></td></tr><tr><td>EGF (Epidermal Growth Factor)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11376454001</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescently Labeled Laminin</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>LMN02</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>VWR</td><td>VWRV0304-10G</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331 or similar</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888-5G</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16634-50mg</td><td></td></tr><tr><td>MepG Dystroglycan Knockout Cells</td><td>LBNL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045 or similar</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75633</td><td></td></tr><tr><td>Ovine Prolactin</td><td>Los Angeles Biomedical Research Institute</td><td>Ovine Pituitary Prolactin</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Thermo</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Thermo</td><td>10010023 or similar</td><td></td></tr><tr><td>Purified Laminin-111</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human Nidogen-1, carrier free</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>2570-ND-050</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889 or similar</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cacodylate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filters</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS or similar</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252859 or similar</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-low protein binding tubes</td><td>VWR</td><td>76322-516, 76322-522 or similar</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Thermo</td><td>15230253 or similar</td><td></td></tr></tbody></table>

generating a fractal microstructure of laminin-111 to signal to cells

Laminin-111 (Ln1) הוא חלק חיוני של המטריצה החוץ תאית באפיתליה, שרירים ומערכות עצביות. הראינו בעבר שהמיקרו-מבנה של Ln1 משנה את האופן שבו הוא מאותת לתאים, אולי משום שהרכבת Ln1 לרשתות חושפת תחומי דבק שונים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שלוש שיטות ליצירת Ln1 פולימרי.

Laminin-111 הוא חלבון טרימרי עם שלושה תחומי הרכבה עצמית בקצה זרועותיו הקצרות (איור 1A). כאשר הן מטופלות כראוי, הזרועות הקצרות יכולות להתפלמר לסריג משושה (איור 1B,1C), אשר מציג תכונות פרקטליות אגרגטיביות מוגבלות דיפוזיה בסקאלות מרחביות גדולות יותר (<strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Generating a Fractal Microstructure of Laminin-111 to Signal to Cells at JoVE.com

Generating a Fractal Microstructure of Laminin-111 to Signal to Cells

אנו מתארים שלוש שיטות ליצירת פולימרי Ln1 בעלי תכונות פרקטליות המאותתות לתאים באופן שונה בהשוואה ל-Ln1 לא פולימרי.

יצירת מיקרו-מבנה פרקטלי של למינין-111 כדי לאותת לתאים

Laminin-111 (Ln1) is an essential part of the extracellular matrix in epithelia, muscle and neural systems. We have previously demonstrated that the ...

generating-a-fractal-microstructure-of-laminin-111-to-signal-to-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

927 Views.  Texas Heart Institute. אנו מתארים שלוש שיטות ליצירת פולימרי Ln1 בעלי תכונות פרקטליות המאותתות לתאים באופן שונה בהשוואה ל-Ln1 לא פולימרי.

Video: Generating a Fractal Microstructure of Laminin-111 to Signal to Cells

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their extracellular matrix (ECM) environment. Eukaryotic cells constantly sense their local microenvironment through surface mechanosensors to transduce physical changes of ECM into biochemical signals, and integrate these signals to achieve specific changes in gene expression. Interestingly, physicochemical and mechanical parameters of the ECM can couple with each other to regulate cell fate. Therefore, a key to understanding mechanotransduction is to decouple the relative contribution of ECM cues on cellular functions.
Here we present a detailed experimental protocol to rapidly and easily generate biologically relevant hydrogels for the independent tuning of mechanotransduction cues in vitro. We chemically modified polyacrylamide hydrogels (PAAm) to surmount their intrinsically non-adhesive properties by incorporating hydroxyl-functionalized acrylamide monomers during the polymerization. We obtained a novel PAAm hydrogel, called hydroxy-PAAm, which permits immobilization of any desired nature of ECM proteins. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing allows to independently control the morphology of single-cells, the matrix stiffness, the nature and the density of ECM proteins. We provide a simple and rapid method that can be set up in every biology lab to study in vitro cell mechanotransduction processes. We validate this novel two-dimensional platform by conducting experiments on endothelial cells that demonstrate a mechanical coupling between ECM stiffness and the nucleus.

We present a new polyacrylamide hydrogel, called hydroxy-PAAm, that allows a direct binding of ECM proteins with minimal cost or expertise. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing facilitates independent control of many cues of the natural cell microenvironment for studying cellular mechanostransduction.

הכנת הידרוקסי-PAAm הידרוג לצימוד האפקטים של רמזי mechanotransduction

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber diameter, composition and organization. In addition to providing structural support, the physical and chemical properties of the ECM play an important role in multiple cellular processes including adhesion, differentiation, and apoptosis. In vivo, the ECM is assembled by exposing cryptic self-assembly (fibrillogenesis) sites within proteins. This process varies for different proteins, but fibronectin (FN) fibrillogenesis is well-characterized and serves as a model system for cell-mediated ECM assembly. Specifically, cells use integrin receptors on the cell membrane to bind FN dimers and actomyosin-generated contractile forces to unfold and expose binding sites for assembly into insoluble fibers. This receptor-mediated process enables cells to assemble and organize the ECM from the cellular to tissue scales. Here, we present a method termed surface-initiated assembly (SIA), which recapitulates cell-mediated matrix assembly using protein-surface interactions to unfold ECM proteins and assemble them into insoluble fibers. First, ECM proteins are adsorbed onto a hydrophobic polydimethylsiloxane (PDMS) surface where they partially denature (unfold) and expose cryptic binding domains. The unfolded proteins are then transferred in well-defined micro- and nanopatterns through microcontact printing onto a thermally responsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) surface. Thermally-triggered dissolution of the PIPAAm leads to final assembly and release of insoluble ECM protein nanofibers and nanostructures with well-defined geometries. Complex architectures are possible by engineering defined patterns on the PDMS stamps used for microcontact printing. In addition to FN, the SIA process can be used with laminin, fibrinogen and collagens type I and IV to create multi-component ECM nanostructures. Thus, SIA can be used to engineer ECM protein-based materials with precise control over the protein composition, fiber geometry and scaffold architecture in order to recapitulate the structure and composition of the ECM in vivo.

A method to obtain nanofibers and complex nanostructures from single or multiple extracellular matrix proteins is described. This method uses protein-surface interactions to create free-standing protein-based materials with tunable composition and architecture for use in a variety of tissue engineering and biotechnology applications.

Nanofibers חלבון ECM ועצרת ביוזמת פני שטח באמצעות ננו תכנון הנדסי

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration in more appropriate 3D environments, which better resemble the dimensionality of the physiological processes in question. Migratory cells can substantially differ in their morphology and mode of migration depending on whether they are moving on 2D or 3D substrates. Due to technical difficulties and incompatibilities with most standard protocols, structural and functional analysis of cells embedded within 3D matrices still remains uncommon. This article describes methods for preparation and imaging of 3D cancer cell cultures, either as single cells or spheroids. As an appropriate ECM substrate for cancer cell migration, we use nonpepsinized rat tail collagen I polymerized at room-temperature and fluorescently labeled to facilitate visualization using standard confocal microscopes. This work also includes a protocol for 3D immunofluorescent labeling of endogenous cell cytoskeleton. Using these protocols we hope to contribute to a better description of the molecular composition, localization, and functions of cellular structures in 3D.

This article presents a method to fluorescently label collagen that can be further used for both fix and live imaging of 3D cell cultures. We also provide an optimized protocol to visualize endogenous cytoskeletal proteins of cells cultured in 3D environments.

חושף את ארגון cytoskeletal של תאי סרטן פולשני ב-3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

Medicine

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

כמו כריך microenvironments לרתום ניידים / חומרי אינטראקציות

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or tissues. Up to date, most in vitro systems rely on two-dimensional (2D) surfaces, such as cell-culture plates or coverslips. To optimally mimic physiological conditions in vitro, we utilize a simple 3D collagen matrix. Collagen is one of the major components of extracellular matrix (ECM) and has been widely used to constitute 3D matrices. For 3D imaging, the recently developed light-sheet microscopy technology (also referred to as single plane illumination microscopy) is featured with high acquisition speed, large penetration depth, low bleaching, and photocytotoxicity. Furthermore, light-sheet microscopy is particularly advantageous for long-term measurement. Here we describe an optimized protocol how to set up and handle human immune cells, e.g. primary human cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells in the 3D collagen matrix for usage with the light-sheet microscopy for live cell imaging and fixed samples. The procedure for image acquisition and analysis of cell migration are presented. A particular focus is given to highlight critical steps and factors for sample preparation and data analysis. This protocol can be employed for other types of suspension cells in a 3D collagen matrix and is not limited to immune cells.

Here, we present a protocol to visualize immune cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen matrix using light-sheet microscopy. This protocol also elaborates how to track cell migration in 3D. This protocol can be employed for other types of suspension cells in the 3D matrix.

מיקרוסקופ אור גיליונות עבור ויזואליזציה תלת מימדי של תאים חיסוניים אנושי

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

Immunology and Infection

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer length scale allows the use of these patterned contact zones for the measurement of traction forces, as each micropatterned dot allows for the formation of a single focal adhesion that then deforms the soft, underlying hydrogel. This approach has been used for a wide range of cell types, including endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, platelets, and epithelial cells. 
This review describes the evolution of techniques that allow the printing of extracellular matrix proteins onto polyacrylamide hydrogels in a regular array of dots of prespecified size and spacing. As micrometer-scale patterns are difficult to directly print onto soft substrates, patterns are first generated on rigid glass coverslips that are then used to transfer the pattern to the hydrogel during gelation. First, the original microcontact printing approach to generate arrays of small dots on the coverslip is described. A second step that removes most of the pattern to leave islands of small dots is required to control the shapes of cells and cell clusters on such arrays of patterned dots. 
Next, an evolution of this approach that allows for the generation of islands of dots using a single subtractive patterning step is described. This approach is greatly simplified for the user but has the disadvantage of a decreased lifetime for the master mold needed to make the patterns. Finally, the computational approaches that have been developed for the analysis of images of displaced dots and subsequent cell-generated traction fields are described, and updated versions of these analysis packages are provided.

We describe improvements to a standard method for measuring cellular traction forces, based on microcontact printing with a single subtractive patterning step of dot arrays of extracellular matrix proteins on soft hydrogels. This method allows for simpler and more consistent fabrication of island patterns, essential for controlling cell cluster shape.

יצירת תבניות למיקרוסקופיית מתיחה מיקרופטרן

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

המושרה באור Adsorption מולקולרית של חלבונים באמצעות מערכת פרימו עבור מיקרו הפנינג כדי ללמוד התגובות לתא מטריצות חלבונים מטריקס

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...