يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الفوسفور من نهاية خمسة رئيس من جزيئات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي من قبل فئة خاصة من الإنزيمات المعروفة باسم كيناز متعدد النوى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أن لديه القرار للكشف عن تغييرات صغيرة جدا في الحمض النووي وركائز الحمض النووي الريبي. تبدأ من خلال إعداد ردود الفعل كيناز انزيم الحمض النووي الريبي.
لكل رد فعل، والجمع بين ميكرولتر واحد من 500 الركيزة الحمض النووي الريبي نانومولار. 8.3 ميكرولترات من 130 نانوموللار آخر واحد، GRC ثلاثة و 0.2 ميكرولترات من خمسة ملليمولار EDTA. تعيين كتلة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
ثم مزيج 0.5 ميكرولترات من مخزون ATP الفرعية من سلسلة تركيز مع خليط انزيم RNA واحد ووضع التفاعل على كتلة الحرارة. مواصلة خلط ردود الفعل ووضعها على كتلة الحرارة في عشر فترات ثانية. بعد 60 دقيقة حضانة على كتلة الحرارة، وتروي كل رد فعل عن طريق رفع عليه مع 10 ميكرولترات من صبغة تحميل اليوريا.
قم بإجراء تحليل المصب على الفور أو تخزين ردود الفعل عند درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية ليتم تحليلها في وقت لاحق. لإعداد 15٪ denaturing محلول هلام الأكريلاميد، والجمع بين 22.5 ملليلتر من ما قبل مختلطة 40٪ 29 إلى حل واحد أكريلاميد / مكرر الأكريلاميد. ستة ملليلترات من عشرة x TBE.
28.8 غرام من اليوريا. و RNase المياه مجانا إلى حجم إجمالي قدره 59 ملليلتر. ثم يحرك بلطف الحل.
سخني المحلّل في الميكروويف لمدة 20 ثانية. اثارة عليه وإعادته على الفور إلى الميكروويف لمدة 20 ثانية أخرى. يحرك بلطف الحل حتى يتم حل اليوريا تماما.
ضع كوب الزجاج في حمام ماء ضحل ، يحتوي على الماء البارد لمدة خمس دقائق ، مع التأكد من أن مستوى الماء البارد المحيط بقارب الزجاج أعلى من مستوى الحل داخل كوب الزجاج. عندما يكون الحل بارد، تصفية وإزالة الغاز مع 0.2 اثنين من وحدة الترشيح ميكرومتر المتاح لإزالة الجسيمات وفقاعات الهواء المجهرية. اغسلي لوحة زجاجية قصيرة وطويلة بالصابون والماء ثم رش كل طبق بنسبة 95٪ الإيثانول وامسحي الزجاج لإزالة أي رطوبة.
رفع لوحة طويلة قبالة أعلى مقاعد البدلاء عن طريق وضعه على رأس مربع. ثم ضع 0.4 ملليمتر الفواصل على طول حواف طويلة من لوحة. وضع لوحة قصيرة على رأس لوحة طويلة، والتأكد من أن حواف لوحة قصيرة، لوحة طويلة والفواصل هي الانحياز.
ثم المشبك كل جانب مع ثلاثة المشابك المعدنية متباعدة بالتساوي. أضف 24 ميكرولترات من TEMED إلى محلول الأكريلاميد واخلطه. ثم إضافة 600 ميكرولترات من 10٪ APS وعلى الفور صب الحل بين لوحات الزجاج.
صب حل الاكريلاميد بين شطيرة لوحة الزجاج يمكن أن يكون تحديا حقا. لتجنب فقاعات الهواء، اضغط على شطيرة لوحة الزجاج أثناء صب الحل الخاص بك. إضافة بعناية نظيفة 32-جيدا مشط إلى الجزء العلوي من شطيرة لوحة زجاجية.
واسمحوا الأكريلاميد البلمرة لمدة 30 دقيقة. لتشغيل الجل، تعيين كتلة الحرارة إلى 75 درجة مئوية. إزالة المشابك المعدنية.
وغسل جيدا وتجفيف شطيرة لوحة الزجاج. وضع شطيرة لوحة وجهاز هلام مع لوحة قصيرة تواجه إلى الأمام وإعداد 0.5 X TBE تشغيل العازلة من خلال الجمع بين 100 ملليلتر من 10 X TBE مع 1.9 لتر من المياه الحرة RNase. إضافة 600 ملليلتر من المخزن المؤقت تشغيل إلى الغرف العليا والسفلى من الجهاز.
قم بإزالة المشط بلطف من الجل وشطف الآبار جيدًا باستخدام حقنة. تشغيل ما قبل هلام في 50 واط لمدة 30 دقيقة. ثم شطف الآبار مرة أخرى.
آخر تدور ردود الفعل إخماد واحتضان لهم في 75 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. كرر نبض تدور وتحميل على الفور 10 ميكرولترات من كل عينة على هلام. ثم تشغيل هلام لمدة ثلاث ساعات في 50 واط.
عندما انتهت المدى، إيقاف التيار الكهربائي واستنزاف الغرفة العليا للجهاز. غسل وتجفيف الجانب الخارجي من شطيرة لوحة الزجاج. ثم غطيها بورق ونقلها إلى ماسح ليزر للتصوير.
جبل شطيرة لوحة الزجاج على خشبة المسرح من الماسح الضوئي بالليزر. تعيين الإثارة وأطوال موجية الانبعاثات للأرضية المطلوبة لصورة هلام. يظهر هنا هو ممثل هلام denaturing ناجحة من المعايرة ATP مع كمية ثابتة من آخر GRC ثلاثة مجمع.
إضافة الإنزيم أدى إلى آخر واحد توسطت الجيش الملكي النيبالي انشقاق من Saccharomyces cerevisiae ITS اثنين من الركيزة RNA، مما أدى إلى جزء RNA محددة. عند إضافة ATP، تم فسفور شظايا الحمض النووي الريبي C2 بواسطة GrC3 PNK. لتصور الفسففور من شظايا الحمض النووي الريبي C2، تم رسم الكمية النسبية من الحمض النووي الريبي C2 غيرphosphorylated وفسفورية ضد تركيز ATP.
ممثلنا غير ناجحة هلام denaturing يظهر هنا. وتحتوي الركيزة الـ 21 من النيوكليوتيدات RNA على منتجات تحلل، تتداخل مع المنتج الفوسفوري وجعلت من المستحيل تحديد الفوسفور بدقة. وعلى النقيض من ذلك، يمكن تحليل أدنى ناتج لتحلل الحمض النووي الريبي بنجاح لأن هذه المنطقة من الجل لم تتضمن أي أنواع إضافية من الحمض النووي الريبي تعوق التحديد الكمي الدقيق لنظيرها الفوسفوري.
أهم شيء أن نتذكر عند محاولة هذا البروتوكول هو شطف آبار هلام لضمان تحميل حتى من العينة الخاصة بك. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء تجربة دوران RNA. لقياس معدلات تحلل الحمض النووي الريبي، غالباً ما يشير التفسيّر إلى بدء تحلل الحمض النووي الريبي.
هذه التقنية تمهد الطريق للإجابة على الأسئلة التفصيلية حول خصوصية الأنشطة والحركات من الكنايات المتعددة النوى.
