Bu yöntem, DNA veya RNA moleküllerinin beş asal ucunun fosforilasyonuna ilişkin anahtar soruları polinükleotid kinaz olarak bilinen özel bir enzim sınıfı ile yanıtlayabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, DNA ve RNA yüzeylerinde çok küçük değişiklikleri tespit etme çözünürlüğüne sahip olmasıdır. RNA enzimkinaz reaksiyonlarını hazırlayarak başlayın.
Her reaksiyon için, 500 nanomolar RNA substrat bir mikrolitre birleştirin. 8.3 mikrolitre 130 nanomolar son bir, GRC üç ve beş milimolar EDTA 0.2 mikrolitre. Isı bloğunu 37 dereceye ayarlayın.
Daha sonra konsantrasyon serisinden bir ATP alt stokunun 0,5 mikrolitresini bir RNA enzim karışımıyla karıştırın ve reaksiyonu ısı bloğuna yerleştirin. Reaksiyonları karıştırmaya ve on saniye aralıklarla ısı bloğuna yerleştirmeye devam edin. Isı bloğunda 60 dakikalık bir kuluçkadan sonra, her reaksiyonu 10 mikrolitre üre yükleme boyası ile şişirerek söndürün.
Hemen aşağı analizi gerçekleştirmek veya negatif 20 santigrat derece daha sonraki bir tarihte analiz edilecek reaksiyonlar saklayın. %15 denaturing akrilamid jel çözeltisi hazırlamak için, 22,5 mililitre önceden karıştırılmış 40%29 ile bir akrilamid/bis akrilamid çözeltisini birleştirin. On x TBE altı mililitre.
28.8 gram üre. Ve toplam 59 mililitre lik bir hacimde serbest su layın. Sonra yavaşça çözüm karıştırın.
Çözeltiyi mikrodalgafırında 20 saniye ısıtın. Karıştırın ve hemen başka bir 20 saniye için mikrodalga geri dönün. Üre tamamen eriyene kadar çözeltiyi hafifçe karıştırın.
Cam kabı, cam kabıçevreleyen soğuk su seviyesinin cam kabın içindeki çözelti seviyesinin üzerinde olduğundan emin olmak için beş dakika boyunca soğuk su içeren sığ bir su banyosuna yerleştirin. Çözelti soğuduğunda, partikülleri ve mikroskobik hava kabarcıklarını temizlemek için 0,2 mikrometrelik tek kullanımlık filtrasyon ünitesi ile filtreleyin ve gazdan arındırın. Kısa ve uzun cam bir tabağı sabun ve suyla yıkayın ve her tabayı %95 etanol ile püskürtün ve nemi gidermek için camı silin.
Uzun plakayı bir kutunun üzerine koyarak yedek tezgahın üstünden yükseltin. Daha sonra plakanın uzun kenarları boyunca 0,4 milimetrelik boşlukkonumlandırın. Kısa plakayı uzun plakanın üzerine yerleştirin, kısa plakanın kenarlarının, uzun plakanın ve boşluklayıcıların hizalandığından emin olun.
Daha sonra her iki tarafı üç eşit aralıklı metal kelepçeyle kelepçele. Akrilamid çözeltisine 24 mikrolitre TEMED ekleyin ve karıştırın. Sonra% 10 APS 600 mikrolitre ekleyin ve hemen cam plakalar arasında çözüm dökün.
Cam plakalı sandviç arasına akrilamid çözeltisi dökmek gerçekten zor olabilir. Hava kabarcıkları önlemek için, çözüm dökerken cam plakalı sandviç dokunun. Dikkatle cam tabak sandviç üstüne temiz bir 32-well tarak ekleyin.
Ve akrilamidin 30 dakika polimerleşmesine izin verin. Jelçalıştırmak için, 75 santigrat derece ısı bloğu ayarlayın. Metal kelepçeleri çıkarın.
Ve iyice yıkayın ve cam tabak sandviç kuru. Plakalı sandviçi ve jel aparatı ile kısa plakayı öne bakacak şekilde yerleştirin ve 10 X TBE'nin 100 mililitresini 1,9 litre RNase serbest su ile birleştirerek 0,5 X TBE çalışan tampon hazırlayın. Cihazın üst ve alt odalarına çalışan tampon 600 mililitre ekleyin.
Taraktan yavaşça çıkarve kuyuları bir şırınga ile iyice durulayın. Jeli 30 dakika boyunca 50 Watt'ta önceden çalıştırın. Sonra kuyuları tekrar durulayın.
Post söndürme reaksiyonları spin ve üç dakika boyunca 75 santigrat derece onları kuluçka. Darbe dönüşünü tekrarlayın ve her numunenin 10 mikrolitresini hemen jelüzerine yükleyin. Sonra 50 Watt'ta jeli üç saat çalıştırın.
Çalışma bittiğinde, güç kaynağını kapatın ve cihazın üst haznesini boşaltın. Cam plakalı sandviçin dış tarafını yıkayın ve kurutun. Sonra folyo ile kaplayın ve görüntüleme için bir lazer tarayıcı aktarın.
Cam plakalı sandviçi lazer tarayıcının sahnesine monte edin. İstenilen zemin için uyarma ve emisyon dalga boylarını ayarlayın ve jeli görüntüleyin. Burada gösterilen son bir GRC üç karmaşık sabit bir miktar ile ATP bir titrasyon temsilcisi başarılı denaturing jel.
Enzimin eklenmesi, Saccharomyces cerevisiae ITS iki RNA substratının son bir aracılı RNA bölünmesiile sonuçlandı ve tanımlanmış bir RNA parçasına yol açtı. ATP'nin eklenmesiyle C2 RNA parçası GrC3 PNK tarafından fosforlandı. C2 RNA parçasının fosforilasyonunu görselleştirmek için, göreceli miktarda fosforilasyonsuz ve fosforlu C2 RNA ATP konsantrasyonuna karşı çizilmiştir.
Temsilcimiz başarısız denaturing jel burada gösterilmiştir. 21 nükleotit RNA substratı, fosforilasyonlu ürünle örtüşen ve fosforilasyonun doğru bir şekilde ölçülmesini imkansız hale getiren bozunma ürünleri içeriyordu. Buna karşılık, jelin bu alanı fosforlu muadili doğru nicelliği engelleyen herhangi bir ek RNA türü içermediğinden, en kısa RNA bozunma ürünü başarıyla analiz edilebilir.
Bu protokolü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, numunenizin eşit şekilde yüklendiğinden emin olmak için jel kuyularını durulamaktır. Bu yordamı takiben bir RNA ciro deneyi yapılabilir. RNA bozulma oranlarını ölçmek için, fosforilasyon genellikle RNA bozulmasının başlatılmasını işaretler.
Bu teknik, polinükleotid kinazların aktivite özgüllüğü ve kinetikleri hakkında ayrıntılı soruların cevaplanmasının önünü açmektedir.
