תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים

שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח על זרחון של הקצה החמישי של מולקולות DNA או RNA על ידי מחלקה מיוחדת של אנזימים המכונה פולינוקלאוטידים קינאז. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שיש לו את הרזולוציה לזהות שינויים קטנים מאוד במצעי DNA ו- RNA. התחל על ידי הכנת תגובות קינאז אנזים RNA.

עבור כל תגובה, לשלב מיקרוליטר אחד של מצע RNA ננו-מולאר 500. 8.3 מיקרוליטרים של 130 ננומולרים האחרון, GRC שלוש ו 0.2 microliters של חמישה מילימולרים EDTA. הגדר את בלוק החום ל 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן מערבבים 0.5 מיקרוליטרים של תת-מלאי ATP מסדרת הריכוז עם תערובת אנזימי RNA אחת ומ מניחים את התגובה על בלוק החום. המשך לערבב את התגובות ומניח אותם על בלוק החום במרווחים של עשר שניות. לאחר דגירה של 60 דקות על בלוק החום, מרווה כל תגובה על ידי spiking אותו עם 10 microliters של צבע טוען אוריאה.

מיד לבצע ניתוח במורד הזרם או לאחסן את התגובות ב 20 מעלות צלזיוס שלילי כדי לנתח במועד מאוחר יותר. כדי להכין פתרון ג'ל אקרילאמיד 15%, שלבו 22.5 מיליליטר של 40%29 טרום-מעורבות לתס אקרילמיד/ביס אקרילאמיד אחד. שישה מיליליטר של עשרה x TBE.

28.8 גרם של אוריאה. ומים חופשיים RNase לנפח כולל של 59 מיליליטר. ואז בעדינות מערבבים את הפתרון.

מחממים את הפתרון במיקרוגל במשך 20 שניות. מערבבים אותו ומיד מחזירים אותו למיקרוגל למשך 20 שניות נוספות. מערבבים בעדינות את הפתרון עד שהאוריאה מתמוססת לחלוטין.

מניחים את הזכוכית לתוך אמבט מים רדודים, המכיל מים קרים במשך חמש דקות, מוודא כי מפלס המים הקרים המקיפים את הזכוכית הוא מעל לרמת הפתרון בתוך הזכוכית. כאשר הפתרון הוא מגניב, לסנן דה גז זה עם 0.2 יחידת סינון חד פעמי מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים בועות אוויר מיקרוסקופיות. לשטוף צלחת זכוכית קצרה וא ארוכה עם מים וסבון ואז לרסס כל צלחת עם 95% אתנול ולנגב את הזכוכית כדי להסיר כל לחות.

לרומם את הצלחת הארוכה מהספסל העליון על ידי הנחת אותו על גבי תיבה. לאחר מכן מקם 0.4 מילימטר רווחים לאורך הקצוות הארוכים של הצלחת. מניחים את הצלחת הקצרה על גבי הצלחת הארוכה, מוודאים כי הקצוות של הצלחת הקצרה, צלחת ארוכה ומרחבים מיושרים.

לאחר מכן מהדקים כל צד בשלושה מלחצי מתכת במים באופן שווה. הוסף 24 מיקרוליטרים של TEMED לפתרון האקרילמיד וערבב אותו. לאחר מכן מוסיפים 600 מיקרוליטרים של 10% APS ומיד יוצקים את הפתרון בין צלחות הזכוכית.

שפיכת פתרון האקרילמיד בין כריך צלחת הזכוכית יכולה להיות ממש מאתגרת. כדי למנוע בועות אוויר, הקש על כריך צלחת הזכוכית בזמן שאתה מוזג את הפתרון שלך. בזהירות להוסיף מסרק נקי 32 היטב לראש כריך צלחת זכוכית.

ולאפשר לאקרילאמיד לפולימריזציה למשך 30 דקות. כדי להפעיל את הג'ל, להגדיר את בלוק החום ל 75 מעלות צלזיוס. הסר את מלחצי המתכת.

ולשטוף ולייבש ביסודיות את כריך צלחת הזכוכית. מקם את כריך הצלחת ואת מנגנון הג'ל עם הצלחת הקצרה הפונה קדימה והכן חיץ ריצה של 0.5 X TBE על ידי שילוב של 100 מיליליטר של 10 X TBE עם 1.9 ליטר מים חופשיים RNase. הוסף 600 מיליליטר של המאגר פועל לחדרים העליונים והתחתונים של המנגנון.

מוציאים בעדינות את המסרק מהסיר ושטיפת בארות ביסודיות במזרק. יש להפעיל מראש את הג'ל ב-50 וואט למשך 30 דקות. ואז לשטוף את בארות שוב.

פוסט לסובב את התגובות להתרווה ותגרור אותם ב 75 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. חזור על ספין הדופק ומיד לטעון 10 microliters של כל מדגם על הג'ל. ואז להפעיל את הג'ל במשך שלוש שעות ב 50 וואט.

לאחר סיום הריצה, כבה את ספק הכוח ורוקן את התא העליון של המנגנון. לשטוף ולייבש את הצד החיצוני של כריך צלחת הזכוכית. לאחר מכן לכסות אותו עם נייר כסף ולהעביר אותו לסורק לייזר להדמיה.

הר את כריך צלחת הזכוכית על הבמה של סורק הלייזר. הגדר את אורכי הגל של העירור וההפחתה עבור הרצפה הרצויה ודמיין את הג'ל. מוצג כאן הוא ג'ל denaturing מוצלח נציג של טיטרציה של ATP עם כמות קבועה של האחרון GRC שלוש קומפלקס.

תוספת של אנזים הביא מחשוף RNA מתווך האחרון של Saccharomyces cerevisiae שני מצע RNA שלה, המוביל שבר RNA מוגדר. עם הוספת ATP, שבר C2 RNA היה זרחן על ידי GrC3 PNK. כדי לדמיין את הזרחון של שבר C2 RNA, הכמות היחסית של רנ"א C2 לא פוספוסורי וזרחני היה התווה נגד ריכוז ATP.

ג'ל denaturing הנציג שלנו לא מוצלח מוצג כאן. מצע 21 נוקלאוטיד RNA הכיל מוצרי השפלה, אשר חופפים עם המוצר phosphorylated ולא אפשר לכמת במדויק זרחון. לעומת זאת, ניתן לנתח בהצלחה את מוצר השפלת ה-RNA הקצר ביותר מכיוון שאזור זה של הג'ל לא הכיל מינים נוספים של רנ"א שעיכבו כימות מדויק של מקבילו הזרחני.

הדבר החשוב ביותר לזכור בעת ניסיון פרוטוקול זה הוא לשטוף את הבארים של הג'ל כדי להבטיח אפילו טעינה של המדגם שלך. בעקבות הליך זה, ניסוי תחלופת RNA יכול להתבצע. כדי למדוד את שיעורי השפלה RNA, זרחון לעתים קרובות מאותת על חניכה של השפלה RNA.

טכניקה זו סוללת את הדרך לענות על שאלות מפורטות על ספציפיות הפעילויות וקינטיקה של קינאזות פולינוקלאוטיות.