تعد مادة الفوسفات غير العضوية عنصراً أساسياً في الاستجابة للإجهاد البكتيري. ولكن الطرق القديمة لاستخراج وقياس ال polyP في البكتيريا معقدة وكثيفة العمالة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتكون الكمي السريع والحساس وغير المكلف لمستويات الـ polyP في مجموعة متنوعة من الأنواع البكتيرية المختلفة.
سيتم إثبات الإجراء من قبل آريا بوهرل، طالبة جامعية من مختبري. للبدء، تنمو بكتيريا reuteri الملبابة في المتوسط التعريفي انزيم مالي دون السيستين في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها دون اهتزاز. أجهزة الطرد المركزي ملليلتر واحد من هذه الثقافة بين عشية وضحاها في أنبوب 1.5 ملليلتر microcentrifuge لحصاد ما يكفي من الخلايا تسفر عن ما مجموعه 50 إلى 100 ميكروغرام من البروتين الخلوي.
إزالة supernatant من بيليه الخلية تماما، ومن ثم إضافة 250 ميكرولترس GITC تحلل العازلة وsususpend من قبل دوامة. احتضان في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لlyse الخلايا. تخزين lysate في 80 درجة مئوية.
أولاً، إعداد معايير BSA التي تحتوي على صفر، 1، 2، و4 ملليغرام لكل ملليلتر من BSA في العازلة تحلل GITC. Aliquot خمسة ميكرولترات من ذوبان، مختلطة جيدا الخلية lysates وخمسة microliters من معايير BSA لفصل الآبار في لوحة 96 بئر واضحة. إضافة 195 microliters من برادفورد الكاشف إلى كل بئر وقياس امتصاص في 595 نانومتر في قارئ لوحة.
احسب كمية البروتين في كل بئر بالمقارنة مع منحنى BSA القياسي كما هو موضح في المخطوطة. لتحديد المبلغ الإجمالي للبروتين في كل عينة، اضرب القيمة الناتجة بـ 05. لبدء استخراج البولي فوسفات، إضافة 250 ميكرولترات من 95٪ الإيثانول لكل عينة GITC lysed، ودوامة لخلط.
Pipette هذا الخليط إلى عمود تدور غشاء السيليكا وضعت في أنبوب جهاز طرد مركزي 1.5 ملليلتر. جهاز طرد مركزي عند 16، 100 غرام لمدة 30 ثانية. تخلص من التدفق من خلال وإضافة 750 ميكرولتردات من ثلاثيات هيدروكلوريد، كلوريد الصوديوم، EDTA، وخليط الإيثانول.
جهاز طرد مركزي في 16، 100 gs لمدة 30 ثانية. تجاهل تدفق من خلال والطرد المركزي في العمود تدور في 16، 100 gs لمدة دقيقتين. ضع العمود في أنبوب مجهري نظيف 1.5 ملليلتر.
إضافة 150 ميكرولترات من 50 ملليمولار درجة حًى حر ثمانية ثلاثية هيدروكلوريد، وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. Elute polyP بواسطة الطرد المركزي في 8، 000 غرام لمدة دقيقتين. ابدأ بإعداد معايير تحتوي على صفر أو خمسة أو 50 أو 200 فوسفات بوتاسيوم ميكرومولر في 50 ملليمولار pH ثمانية ثلاثيات هيدروكلوريد.
Aliquot 100 ميكرولترات من كل معيار الفوسفات و 100 ميكرولترات من عينات من مادة الوَيَض المُستخرجة إلى آبار منفصلة من 96 بئراً واضحة. إعداد مزيج رئيسي يحتوي، لكل عينة، 30 ميكرولترات من 5X Scppx العازلة التفاعل، 19 ميكرولترتر المياه، وميكر واحد من Scppx المنقى. إضافة 50 ميكرولترات من المزيج الرئيسي إلى كل بئر من 96 لوحة البئر.
واحتضان لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية. في يوم الكشف، وإعداد مخزون جديد من العمل من محلول الكشف عن طريق خلط في 9.12 ملليلتر من قاعدة حل الكشف مع 88 ملليلتر من حمض الأسكوربيك الضرس الضرس واحد، والسماح لها أن تأتي إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. إضافة 50 ميكرولترات من حل الكشف عن كل عينة والمعايير في لوحة 96 جيدا.
للسماح بتطوير الألوان، احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين تقريبا. استخدام قارئ لوحة لقياس امتصاص في 882 نانومتر وحساب تركيز الفوسفات لكل عينة بالمقارنة مع منحنى الفوسفات البوتاسيوم القياسية. ثم قم بتحويل تركيزات الفوسفات إلى نانوموليات من الفوسفات المشتق من الـ polyP في كل خلية وتطبيع محتوى البوليب الخلوي إلى البروتين الخلوي الكلي، كما هو موضح في المخطوطة.
البرية من النوع E.coli، بكتيريا سلبية الغرام، نمت في LB أنتجت أي بوليب. ولكن عندما نمت في MOPS، أنتجت حوالي 192 نانوموليات بوليوم لكل ملليغرام من البروتين الكلي. ولم تنتج متحولة دلتا الإشريكية القولونية، التي تفتقر إلى كيناز ال polyP، أي مادة متعددة الوب في أي من الوسطين.
أنتجت متحولة دلتا ppx ، التي تفتقر إلى exopolyphosphatase ، ما يقرب من نفس الكمية من البوليفين مثل النوع البري. والدلتا phoB متحولة ، وهو معيب في نقل الفوسفات ، وتنتج أقل بكثير من بوليب البرية. البرية من النوع L.reuteri، بكتيريا إيجابية الغرام نمت بين عشية وضحاها في وسط MEIC تراكمت حوالي 51 نانومولية بوليوم لكل ملليغرام من البروتين الكلي.
A L.reuteri ppk1 متحولة خالية تفتقر إلى كيناز متعدد الوب تحتوي على أقل من نصف هذا المبلغ. هذا وجود من بوليP في ppk1 متحولة فارغة هو على الارجح بسبب L.reuteri تحتوي على كيناز متعدد الوب الثاني. Mycobacterium smegmatis سلالة SMR خمسة، نمت في هارتمانس دي بونت المتوسطة في غياب الإيثانول المتراكمة حوالي 141 نانوموليس بوليوم لكل ملليغرام من البروتين الكلي.
في حين أن العلاج الإيثانول أدى إلى زيادة ثلاثة أضعاف. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء جل الأكريلاميد الكهربائي لتقييم الاختلافات في طول سلسلة البوليب. أثناء محاولة هذا الإجراء، تجنب الأخطاء الشائعة.
تذكر أن تتجنب الحصول على فقاعات في آبار لوحة microtiter ، وأن تكون حريصًا على نقل العينات إلى الأنبوب المناسب عند التبديل من العمود إلى أنبوب microfuge. لا تنس أن العمل مع GITC والأحماض القوية يمكن أن تكون خطرة، وينبغي دائماً ارتداء معدات الحماية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
