هذا البروتوكول حقن داخل الجمجمة مهم لأنه يسمح الحقن الدقيق, الرصد اليومي, وقياس حجم الورم دقيقة لدراسة أكثر فعالية لآليات الانبثاث الدماغ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالرصد التسلسلي لنمو الورم بين الطوائف. ومن خلال هذا الإجراء، سيكون جوناثان سبهار، وهو باحث جامعي مشارك من مختبر Sizemore، وآنا براتاز، وهي عالمة أبحاث تصوير من جامعة ولاية أوهايو، وهي مورد مشترك لتصوير الحيوانات الصغيرة.
قبل البدء في الإجراء، تحريف قفل المرحلة على الحفر للسماح لمحول بت الحفر وعقيمة بت حفر ملليمتر واحد ليتم إدراجها في الحفر وتشديد أقفال بت يدويا لقفل الحفر. إرفاق الحفر إلى إطار stereotactic وتعيين معدل تسليم حاقن الرقمية إلى 0.4 ميكرولترات في الدقيقة الواحدة، مع هدف اثنين من microliters. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لدواسة منعكس، وضع الماوس تخدير على الإطار واستخدام نهاية حادة من قضيب طرف القطن لوضع الأسنان في الحوض الصغير من شريط الفم.
اضغط على شريط الأذن اليسرى ضد القنينة الوسطى للأذن اليسرى لتثبيت الجمجمة واستخدام المسمار على إطار stereotactic لقفل الجمجمة في مكانها. ثم قم بتأمين الجانب الآخر من الجمجمة بشريط الأذن الأيمن بنفس الطريقة. لجعل نافذة الكالفاري، وتنظيف فروة الرأس مع ثلاثة متتابعة بالتناوب حل Betadine و 70٪ الإيثانول الدعك واستخدام مشرط معقم لجعل شق ثلاثة ملليمتر من خلال الجلد على طول الجانب المركزي المتوسط من الجمجمة بعد خط خياطة القوس.
تحديد وتوجيه بت الحفر العقيم عمودي على bregma، والتأكد من إعادة تعيين مقياس vernier الرقمية إلى الصفر ونقل بت حفر بت اثنين ملليمترات الجانبي إلى خياطة القوس واحد ملليمتر أمامي إلى خياطة التاجية. نقل الجلد بعيدا عن الحفر واستخدام أعلى سرعة وإيلاء الاهتمام للمعالم، وحفر بعناية حفرة، ما يقرب من 0.5 ملليمتر عميق، من خلال الكالفاريا، وتبريد موقع الحفر مع قطرات من المالحة العقيمة حسب الضرورة. مرة واحدة وقد أدلى نافذة العجلية، بعناية رفع الحفر وإزالة الحفر من الإطار المجسم.
لحقن الخلايا السرطانية، قم بتوصيل وحدة الحقن التلقائية بجهاز المجسم وتحميل الستة إلى ثمانية ميكرولترات من الخلايا التي يتم توزيعها بدقة في DPBS في حقنة هاميلتون العقيمة. تحميل الحقنة على حاقن والاستغناء عن حجم صغير من الحل على الستائر العقيمة المتاح لرئيس الإبرة للحقن. استخدام قضيب طرف القطن لمسح حقنة مع 70٪ الإيثانول ومحاذاة طرف إبرة إلى وسط النافذة الكالفاري حتى يمس ما يقرب من المخ المكشوف.
إعادة تعيين مقياس vernier الرقمية إلى الصفر وأدخل ببطء الإبرة في عمق ثلاثة ملليمتر في الدماغ. اترك الإبرة في الدماغ لمدة 60 ثانية على الأقل قبل اختيار الركض على شاشة الحقن لبدء توصيل الخلايا إلى موقع الحقن. عندما يتم تسليم جميع الخلايا، والسماح للإبرة للراحة في الدماغ لمدة ثلاث دقائق على الأقل للسماح للدماغ parenchyma للتأقلم مع الحقن قبل سحب الإبرة من الدماغ بمعدل 0.75 ملليمتر في الدقيقة الواحدة.
للتصوير بالرنين المغناطيسي لعبء الورم، 10 إلى 20 دقيقة قبل التصوير في الوقت التجريبي المناسب، وإدارة 100 ميكرولترات لكل 20 غراما من وزن الجسم gadolinium القائم على العوامل التباين إلى الماوس عن طريق الحقن القياسية intraperitoneal. تخدير الماوس بعد الحقن ووضع الماوس تخدير على حامل ساخنة. ضع الحامل في مغناطيس 9.4 T مجهز بلفائف سطح دماغ الماوس والحصول على صورة محلية.
ثم صورة الدماغ الماوس باستخدام تسلسل T2 نادرة مرجحة وآخر gadolinium القائم على النقيض T1 تسلسل مرجح نادرة. لقياس حجم الورم الكلي، افتح ملف بيانات MRI الذي يهم ImageJ واستخدم أداة تحديدات اليد الحرة لرسم مخطط حول الورم. ثم افتح علامة التبويب تحليل وحدد قياس للحصول على مساحة المنطقة المحددة.
عندما تم تقييم كل من الورم الذي يحتوي على شرائح للماوس الفردية في تلك النقطة الزمنية المحددة، تصدير القيم إلى برنامج تحليل البيانات المناسبة. هنا، يمكن ملاحظة نظرة عامة تمثيلية لحجم الورم الكمي لماوس واحد في اليوم 7 واليوم 10 بعد حقن الخلايا الورمية ماماري. وكشف تقييم 30 شريحة لكل مسح أنه لهذا التحليل، في اليوم السابع بعد الحقن، أظهرت خمس شرائح عبئاً على الورم.
بينما في اليوم 10، أظهرت تسع شرائح عبء ورم. ثم تم قياس منطقة الورم في كل صورة كما هو موضح ، مما يسمح لتتبع التغير في حجم الورم بمرور الوقت. كل خط الخلية وكل نموذج الماوس المتلقي هي فريدة من نوعها، وبالتالي يتطلب تحسين عدد الخلايا التي حقنت والجدول الزمني للتصوير بالرنين المغناطيسي لضمان دقة التصوير.
بعد هذا الإجراء، يمكن حصاد الدماغ لأي مُجرّم مُصبّي، بما في ذلك عزل الخلايا المفردة أو التحليل الهَدَيّ.
