Este protocolo de inyección intracraneal es significativo porque permite inyecciones precisas, monitoreo diario, y medición precisa del volumen tumoral para un estudio más eficaz de los mecanismos de metástasis cerebral. La principal ventaja de esta técnica es que permite el monitoreo en serie del crecimiento del tumor intercraneal. Demostrando el procedimiento estarán Jonathan Spehar, un investigador asociado graduado del Laboratorio Sizemore, y Anna Bratasz, una científica de investigación de imágenes de la Universidad Estatal de Ohio Small Animal Imaging Shared Resource.
Antes de comenzar el procedimiento, gire el bloqueo de etapa en el taladro para permitir que se inserte un adaptador de broca y una broca estéril de un milímetro en el taladro y apriete manualmente los bloqueos de broca para bloquear el taladro. Conecte el taladro al marco estereotáctico y establezca la velocidad de entrega del inyector digital en 0,4 microlitros por minuto, con un objetivo de dos microlitros. Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal, coloque el ratón anestesiado en el marco y utilice el extremo romo de un aplicador de punta de algodón para colocar los dientes en la vaguada de la barra de la boca.
Presione la barra del oído izquierdo contra el canthus medial de la oreja izquierda para estabilizar el cráneo y utilice el tornillo en el marco estereotáctico para bloquear el cráneo en su lugar. A continuación, asegure el otro lado del cráneo con la barra de la oreja derecha de la misma manera. Para hacer una ventana calvarial, limpie el cuero cabelludo con tres solución betadina alternante secuencial y exfoliantes de 70%etanol y utilice un bisturí estéril para hacer una incisión de tres milímetros a través de la piel a lo largo del aspecto medio central del cráneo después de la línea de sutura sagital.
Identifique y oriente la broca estéril perpendicular al bregma, asegurándose de restablecer la escala digital vernier a cero y mueva la broca dos milímetros lateralmente a la sutura sagital y un milímetro anterior a la sutura coronal. Aleje la piel del taladro y utilizando la velocidad más alta y prestando atención a los puntos de referencia, taladre cuidadosamente un agujero, de aproximadamente 0,5 milímetros de profundidad, a través de la calvaria, enfriando el sitio de perforación con gotas de solución salina estéril según sea necesario. Una vez que se haya hecho la ventana calvarial, levante cuidadosamente el taladro y retire el taladro del marco estereotáctico.
Para la inyección de células cancerosas, conecte la unidad inyectora automática al aparato estereotáctico y cargue las seis a ocho microlitros de células completamente resuspendidas en DPBS en una jeringa estéril de Hamilton. Cargue la jeringa en el inyector y dispense un pequeño volumen de solución en una cortina estéril desechable para preparar la aguja para la inyección. Utilice un aplicador de punta de algodón para limpiar la jeringa con 70% de etanol y alinee la punta de la aguja con el centro de la ventana calvarial hasta que casi toque el cerebro expuesto.
Restablezca la escala digital vernier a cero e inserte lentamente la aguja en una profundidad de tres milímetros en el cerebro. Deje la aguja en el cerebro durante al menos 60 segundos antes de seleccionar correr en la pantalla del inyector para comenzar la entrega celular al lugar de inyección. Cuando todas las células han sido entregadas, deje que la aguja descanse en el cerebro durante al menos tres minutos para permitir que el parénquima cerebral se aclimate a la inyección antes de retirar la aguja del cerebro a una velocidad de 0,75 milímetros por minuto.
Para la resonancia magnética de la carga tumoral, de 10 a 20 minutos antes de la toma de imágenes en el punto de tiempo experimental adecuado, administre 100 microlitros por cada 20 gramos de agentes de contraste basados en gadolinio de peso corporal al ratón mediante inyección intraperitoneal estándar. Anestfete el ratón después de la inyección y coloque el ratón anestesiado en un soporte calentado. Coloque el soporte en un imán de 9,4 T equipado con una bobina de superficie cerebral del ratón y obtenga una imagen del localizador.
A continuación, imagine el cerebro del ratón usando una secuencia rara ponderada T2 y post contraste basado en gadolinio T1 secuencia rara ponderada. Para medir el volumen total del tumor, abra el archivo de datos de RMN de interés en ImageJ y utilice la herramienta de selección de manos libres para dibujar un contorno alrededor del tumor. A continuación, abra la pestaña Analizar y seleccione medir para obtener el área de la región seleccionada.
Cuando se hayan evaluado todos los tumores que contienen rebanadas para un ratón individual en ese punto de tiempo específico, exporte los valores a un programa de análisis de datos adecuado. Aquí, se puede observar una visión general representativa de la cuantificación del volumen tumoral para un solo ratón en el día 7 y el día 10 después de la inyección de células tumorales de la mamaria murina. La evaluación de 30 rebanadas por exploración reveló que para este análisis, en el día siete después de la inyección, cinco rebanadas presentaban una carga tumoral.
Mientras que en el día 10, nueve rebanadas exhibieron una carga tumoral. El área tumoral de cada imagen se midió según lo demostrado, lo que permitió rastrear el cambio en el volumen del tumor a lo largo del tiempo. Cada línea de celda y cada modelo de ratón receptor es único y, por lo tanto, requiere la optimización del número de celdas inyectadas y la programación de RMN para garantizar la precisión de las imágenes.
Después de este procedimiento, el cerebro se puede cosechar para esencialmente cualquier ensayo aguas abajo, incluyendo el aislamiento de una sola célula o análisis histopatológico.
