Bu intrakranial enjeksiyon protokolü, beyin metastazı mekanizmalarının daha etkili bir şekilde incelenmesi için hassas enjeksiyonlar, günlük izleme ve doğru tümör hacmi ölçümü sağladığı için önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı interkraniyal tümör büyümesinin seri takibine olanak sağlamasıdır. Prosedürü gösteren Jonathan Spehar, Sizemore Laboratuvarı'ndan bir lisansüstü araştırma görevlisi ve Anna Bratasz, Ohio State Üniversitesi Küçük Hayvan Görüntüleme Paylaşılan Kaynak bir görüntüleme araştırma bilim adamı olacaktır.
İşleme başlamadan önce, matkap ucu adaptörü ve steril bir milimetre matkap ucunun matkap içine takılmasına izin vermek için matkap üzerindeki sahne kilidini bükün ve matkabı kilitlemek için bit kilitlerini manuel olarak sıkın. Matkabı stereotaktik çerçeveye takın ve dijital enjektör teslim hızını dakikada 0,4 mikrolitreye ayarlayın ve iki mikrolitrelik bir hedef belirleyin. Pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, anestezili fareyi çerçevenin üzerine yerleştirin ve dişleri ağız çubuğunun çukuruna yerleştirmek için pamuk ucu aplikatörünün künt ucunu kullanın.
Kafatasını stabilize etmek için sol kulağın medial kanthus'una basın ve kafatasını yerine kilitlemek için stereotaktik çerçevedeki vidayı kullanın. Sonra aynı şekilde sağ kulak çubuğu ile kafatasının diğer tarafında güvenli. Bir kalvarial pencere yapmak için, üç sıralı alternatif Betadine çözeltisi ve% 70 etanol scrubs ile kafa derisi temiz ve sagittal sütür hattı aşağıdaki kafatasının merkezi ortanca yönü boyunca deri boyunca üç milimetrelik bir kesi yapmak için steril bir neşter kullanın.
Tanımlanan ve bregma dik steril matkap bit yönlendirmek, sıfıra dijital veron skalası sıfırlamak ve sagittal sütür ve koronal sütür için bir milimetre anterior iki milimetre yanal matkap biti taşımak için emin olun. Cildi matkaptan uzaklaştırın ve en yüksek hızı kullanarak ve simge yapılara dikkat edin, yaklaşık 0,5 milimetre derinliğinde bir delik açarak calvaria'dan geçirin ve gerektiğinde steril tuzlu damlalarla matkap sahasını soğutun. Calvarial pencere yapıldıktan sonra, matkabı dikkatlice kaldırın ve delinme çerçevesinden çıkarın.
Kanser hücresi enjeksiyonu için, stereotaktik cihaza otomatik enjektör ünitesini takın ve DPBS'de iyice askıya alınan altı ila sekiz mikrolitre hücreyi steril hamilton şırıngasına yükleyin. Şırıngayı enjektöre yükleyin ve iğneyi enjeksiyon için astarlamak için tek kullanımlık steril perdeye küçük bir hacimli çözelti dağıtın. Şırıngayı %70 etanolle silmek ve iğne ucunu neredeyse maruz kalan seremoniye dokunana kadar kalvariyal pencerenin ortasına hizalamak için bir pamuk ucu aplikatör kullanın.
Dijital verons ölçeğini sıfırlayıp sıfırla ve iğneyi yavaşça beyne üç milimetre derinliğe takın. İğne yi enjeksiyon bölgesine teslim etmeye başlamak için enjektör ekranında çalıştırmayı seçmeden önce iğneyi en az 60 saniye boyunca beyinde bırakın. Tüm hücreler teslim edildiğinde, iğnenin en az üç dakika boyunca beyinde dinlenmesine izin vererek beyin parankimlerinin iğneyi dakikada 0,75 milimetre hızla beyinden geri çekmeden önce enjeksiyona alışmasını sağlar.
Tümör yükünün manyetik rezonans görüntülemesi için, uygun deneysel zaman noktasında görüntülemeden 10 ila 20 dakika önce, standart intraperitoneal enjeksiyon ile 20 gram vücut ağırlığı gadolinyum bazlı kontrast maddeyi fareye 100 mikrolitre uygulayın. Fareyi enjeksiyon sonrası anesthetize edin ve anestezili fareyi ısıtmalı bir tutucuya yerleştirin. Tutucuyu fare beyin yüzey bobini ile donatılmış 9,4 T mıknatısa yerleştirin ve yerelleştirici görüntü elde edin.
Daha sonra fare beynini T2 ağırlıklı nadir bir dizi ve gadolinyum bazlı kontrast T1 ağırlıklı nadir dizi kullanarak görüntüleyin. Toplam tümör hacmini ölçmek için ImageJ'deki MRG veri dosyasını açın ve tümörün etrafına bir anahat çizmek için serbest el seçimi aracını kullanın. Ardından analiz sekmesini açın ve seçili bölgenin alanını elde etmek için ölçü'ü seçin.
Belirli bir zaman noktasında tek bir fare için dilim içeren tümörün tümü değerlendirildiğinde, değerleri uygun bir veri analizi programına aktarın. Burada, gün 7 ve gün 10 sonrası murine mamitümör hücre enjeksiyonu için tümör hacmi nicelik temsili bir bakış görülebilir. Tetkik başına 30 dilimin değerlendirilmesi, bu analiz için enjeksiyon sonrası yedinci günde beş dilimin tümör yükü sergilediğini ortaya koymuştur.
10. günde, dokuz dilim tümör yükü sergiledi. Her görüntüdeki tümör alanı gösterildiği gibi ölçüldü ve tümör hacmindeki değişimin zaman içinde izlenmesine olanak sağladı. Her hücre hattı ve her alıcı fare modeli benzersizdir ve bu nedenle enjekte edilen hücre sayısının ve görüntüleme doğruluğunun sağlanması için MRI zamanlamasının optimizasyonu gerektirir.
Bu prosedürü takiben, beyin aslında herhangi bir downstream tahlil için hasat edilebilir, tek hücre izolasyonu veya histopatolojik analiz de dahil olmak üzere.
