يوفر هذا البروتوكول إجراءً خطوة بخطوة للكشف عن بؤر إصلاح البروتينات الناجمة عن الإشعاع عن طريق تلطيخ الفلوروس في خطوط خلايا سرطان القولون البشري بعد التشعيع مع الحزمة المختلطة بالنيوترون. التصوير المناعي هو طريقة حساسة ويوفر أدلة بصرية لظهور البروتينات مسار إصلاح في بؤر استجابة للحمض النووي الضارة العوامل، مثل الإشعاع المؤين. ويستخدم شعاع النيوترون المختلط في العلاج بالتقاط النيوترون البورون، BNCT، ولم يتم تحديد استجابة الضرر الناتجة عن الإشعاعات من الحمض النووي.
ويمكن أن يكون بروتوكولنا مفيدًا أيضًا لتحليل الآثار البيولوجية على المستوى الخلوي بسبب الإشعاع بواسطة الحزم الأخرى عالية LET ، مثل البروتونات التي تستخدم العلاج بشعاع البروتون أو أيونات الكربون باستخدام علاج الهادرون. بعد التشعيع، وإزالة المتوسطة من الخلايا المرفقة، وغسلها مرة واحدة مع 2.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. ثم إصلاح الخلايا مع ملليلتر واحد من 70٪ الإيثانول لمدة 10 دقائق.
ل Permeabilize الخلايا، وإزالة الإيثانول، وغسلها مع 2.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. أضف برفق ملليلتر واحد من 2٪ Triton X-100 في PBS لتغطية الأغطية، واحتضان الخلايا لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، ومنع permeabilization مع ملليلتر واحد من 2٪ BSA المخفف في برنامج تلفزيوني.
ثم احتضان الخلايا لمدة لا تقل عن 30 دقيقة مع 2٪ BSA. لتلطيخ الخلايا، أضف الكمية المناسبة من الأجسام المضادة الأولية المخففة في PBS مع BSA، كما هو موصى به في مخطوطة النص. ثم تغطية طبق بيتري، ووضعها في مربع من البلاستيك مع اللجنين المرطب للحفاظ على الرطوبة.
احتضانه لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، قم بإجراء ثلاثة غسلات مع برنامج تلفزيوني، وإضافة الكمية المناسبة من الأجسام المضادة الثانوية. العودة الطبق إلى مربع من البلاستيك مع lignin مرطب، واحتضانه لمدة 30 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية.
ثم كرر يغسل مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 100 ميكرولتر من DAPI المخفف إلى تركيز نهائي من ميكروغرام واحد لكل ملليلتر لضد النوى. احتضان الخلايا لمدة أقصاها دقيقتين في درجة حرارة الغرفة، وتكرار يغسل مع برنامج تلفزيوني. بعد الغسيل الأخير، وإزالة برنامج تلفزيوني، ووضع بلطف غطاء على رأس المتوسطة المتصاعدة، وتجنب تشكيل فقاعات الهواء.
ختم حواف الغطاء مع طلاء الأظافر، والسماح المتوسطة تصاعد لتصلب قبل إجراء المجهر الفلوريس. تم الكشف عن بؤر غاما H2AX ، وهي علامات قياسية لفواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل ، في خلايا سرطان القولون المختلطة بالنيوترونات ، المشعة ، وغير المشععة. تظهر البؤر كنقاط فلورية متميزة.
ولوحظ أن قطرها أعلى من بؤر غاما-H2AX في الخلايا المشعة. وعلاوة على ذلك، تم الكشف عن مسار واحد لجسيمات ألفا عالية LET عبور النواة. تم استخدام المجهر المناعي للكشف عن البروتينات إصلاح تمثيلي Rad52 والبروتين كيناز التي تعتمد على الحمض النووي.
تم قياس قيمة متوسطة عالية من قطر البروتين كيناز البؤر المعتمد على الحمض النووي عند فواصل الحمض النووي بعد التشعيع بالمقارنة مع خلايا التحكم. ولوحظت فواصل مزدوجة التشابك من الحمض النووي في الخلايا المشعة باعتبارها بؤراً أكثر تعقيداً وأكبر وتكتلاً بكثافة أعلى. أهم مرحلة من تلطّخ الفلورة المناعية هي تثبيت الخلايا و حيّانة غشاء الخلية.
هذه الخطوات مطلوبة للسماح للأجسام المضادة باختراق كل من تلك الخلايا و البروتينات داخل الخلايا. هذا الإجراء يعطي معلومات حول تنشيط كل مسار إصلاح على مستوى خلوي. وينبغي بعد ذلك تأكيد النتائج على المستوى الجزيئي باستخدام مقايسة، مثل PCR في الوقت الحقيقي.
هذه التقنية تجعل من الممكن للباحثين لاستكشاف الاستجابة الناجمة عن أضرار الحمض النووي الناجمة عن الإشعاع ، والتي لم يتم تحديدها بالكامل في حالة الحزم المختلفة باستخدام العلاجات المضادة للسرطان.
