פרוטוקול זה מספק הליך שלב אחר שלב לגילוי מוקדים הנגרמים על ידי קרינה של חלבוני תיקון על ידי כתמי immunofluorescence בקווי תאים סרטניים המעי הגס האנושי לאחר הקרנה עם קרן מעורבת נויטרונים. דימות Immunofluorescence היא שיטה רגישה ומספקת ראיות חזותיות להופעת חלבוני מסלול תיקון ב foci בתגובה DNA מזיק סוכנים, כמו קרינה מייננת. קרן מעורבת נויטרונים משמשת בטיפול לכידת נויטרונים בורון, BNCT, ואת התגובה נזק DNA הנגרמת על ידי קרינה לא הוקמה במלואה.
הפרוטוקול שלנו יכול גם להיות שימושי לניתוח של השפעות ביולוגיות ברמה התאית עקב קרינה על ידי קרניים גבוהות אחרות LET, כמו פרוטונים באמצעות טיפול קרן פרוטון או ions פחמן באמצעות טיפול hadron. לאחר ההקרנה, להסיר את המדיום מן התאים המצורפים, ולשטוף אותם פעם אחת עם 2.5 מיליליטר של PBS. ואז לתקן את התאים עם מיליליטר אחד של 70% אתנול במשך 10 דקות.
כדי לחלחל לתאים, להסיר את האתנול, ולשטוף אותם עם 2.5 מיליליטר של PBS. הוסיפו בעדינות מיליליטר אחד של 2%Triton X-100 ב-PBS כדי לכסות את הכיסויים, והדקירה את התאים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS, ולחסום את permeabilization עם מיליליטר אחד של 2%BSA מדולל PBS.
לאחר מכן הדגירה את התאים במשך מינימום של 30 דקות עם 2%BSA. כדי להכתים את התאים, להוסיף את הכמות הנכונה של נוגדן ראשוני מדולל PBS עם BSA, כפי מומלץ בכתב היד טקסט. לאחר מכן מכסים את צלחת פטרי, ומ מניחים אותה בקופסת פלסטיק עם ליגנין לח כדי לשמור על לחות.
דגירה זה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, לבצע שלוש שטיפות עם PBS, ולהוסיף את הכמות הנכונה של נוגדן משני. מחזירים את המנה לקופסת הפלסטיק עם ליגנין לח, וגוררים אותה לפחות 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן חזרו על השטיפה עם PBS, והוסיפו 100 מיקרוליטרים של DAPI מדוללים לריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר כדי לנטרל את הגרעינים. דגירה התאים לכל היותר שתי דקות בטמפרטורת החדר, ולחזור על לשטוף עם PBS. לאחר הכביסה האחרונה, להסיר את PBS, בעדינות לשים כיסוי על גבי המדיום הרכבה, הימנעות היווצרות של בועות אוויר.
לאטום את הקצוות של כיסוי עם לק, ולאפשר מדיום הרכבה להקשיח לפני ביצוע מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. מוקדי גאמא-H2AX, שהם סמנים סטנדרטיים להפסקות דנ"א דו-גדילי, זוהו בתאי סרטן המעי הגס המעורבים בנייטרונים, מוקרנים על-ידי קרן ולא מוקרנים. המוקדים מופיעים כנקודות פלואורסצנטיות נפרדות.
קוטר גבוה יותר של מוקדי גאמא-H2AX נצפה בתאים מוקרנים. יתר על כן, מסלול אחד של חלקיק אלפא בעל LET גבוה זוהה חוצה את הגרעינים. מיקרוסקופיה Immunofluorescence שימש כדי לזהות תיקון מייצג חלבונים Rad52 ו קינאז חלבון תלוי DNA.
ערך ממוצע גבוה של קוטר מוקדי קינאז חלבון תלוי DNA נמדד בהפסקות DNA לאחר הקרנה בהשוואה לתאי בקרה. הפסקות דו-גדיליות של דנ"א מקובצות נצפו בתאים מוקרנים כמוקדים מורכבים יותר, גדולים יותר ומקובצים בעוצמה גבוהה יותר. השלב החשוב ביותר של כתמי שפעת חיסונית הוא קיבעון של תאים ו permeabilization של קרום התא.
צעדים אלה נדרשים כדי לאפשר לנוגדנים לחדור בקלות הן לתאים אלה והן לחלבוני תיקון תאיים. הליך זה מספק מידע על ההפעלה של כל מסלול תיקון ברמה התאית. לאחר מכן יש לאשר את התוצאות ברמה מולקולרית באמצעות בדיקה, כגון PCR בזמן אמת.
טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את תגובת נזקי הדנ"א הנגרמת על ידי קרינה, אשר לא נקבעה במלואה במקרה של קורות שונות באמצעות טיפולים נגד סרטן.
