Bu protokol nötron karışık ışın ile ışınlama sonra insan kolon kanseri hücre hatlarında boyama immünororeskence tarafından onarım proteinleri radyasyon kaynaklı odak tespit etmek için adım adım bir prosedür sağlar. İmmünofloresan görüntüleme hassas bir yöntemdir ve iyonlaştırıcı radyasyon gibi DNA zararlı ajanlarına yanıt olarak foci'deki onarım yolu proteinlerinin görünümü için görsel kanıtlar sağlar. Nötron-karışık ışın bor nötron yakalama tedavisi kullanılır, BNCT, ve radyasyona bağlı DNA hasar yanıtı tam olarak tespit edilmemiştir.
Protokolümüz aynı zamanda proton ışın terapisi kullanan protonlar veya hadron terapisi kullanan karbon iyonları gibi diğer yüksek LET ışınlarının radyasyona bağlı olarak hücresel düzeydeki biyolojik etkilerinin analizinde de yararlı olabilir. Işınlama sonra, bağlı hücrelerden orta çıkarın ve pbs 2,5 mililitre ile bir kez yıkayın. Sonra 10 dakika boyunca% 70 etanol bir mililitre ile hücreleri düzeltmek.
Hücreleri permeabilize etmek için, etanol kaldırmak ve PBS 2.5 mililitre ile yıkayın. Kapak dudaklarını kapsayacak şekilde PBS'ye %2'lik Triton X-100 mililitresini hafifçe ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın ve permeabilizasyonu PBS'de seyreltilmiş %2 BSA'lık bir mililitre ile engelleyin.
Daha sonra%2 BSA ile en az 30 dakika boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın. Hücreleri lekelemek için, metin makalesinde önerildikçe PBS'de BSA ile seyreltilmiş uygun miktarda birincil antikor ekleyin. Sonra Petri çanak kapağı ve nem korumak için nemlendirilmiş lignin ile plastik bir kutuya yerleştirin.
37 derecede 30 dakika kuluçkaya yat. Kuluçkadan sonra, PBS ile üç yıkar ve ikincil antikor uygun miktarda ekleyin. Bulaşıkları nemlendirilmiş lignin içeren plastik kutuya geri verin ve 37 santigrat derecede en az 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra PBS ile yıkar ve çekirdekleri dengelemek için mililitre başına bir mikrogramın son konsantrasyonuna seyreltilmiş 100 mikrolitre DAPI ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında en fazla iki dakika kuluçkaya yatırın ve yıkayıp PBS ile tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, PBS'yi çıkarın ve hava kabarcıklarının oluşmasını önleyerek montaj ortamının üzerine hafifçe bir kapak slip koyun.
Kapak kapağının kenarlarını oje ile kapatın ve floresan mikroskopi yapmadan önce montaj ortamının sertleştirilmesine izin verin. DNA çift iplikli kırıklar için standart belirteçler olan Gamma-H2AX foci, nötron karışık, ışınlanmış ve ışınlanmamış kolon kanseri hücrelerinde tespit edildi. Foci farklı floresan nokta olarak görünür.
Işınlanmış hücrelerde daha yüksek çapta gama-H2AX foci gözlendi. Dahası, yüksek let alfa parçacığının tek bir parçası çekirdekleri geçerken tespit edildi. İmmünofloresan mikroskobu rad52 ve DNA'ya bağımlı protein kiazını temsilen onarım proteinlerini saptamak için kullanıldı.
DNA'ya bağımlı protein kiaz fosçapının ortalama değeri, kontrol hücreleriile karşılaştırıldığında ışınlama sonrası DNA molalarında ölçüldü. Daha karmaşık, daha büyük ve daha yüksek yoğunlukta kümelenmiş fosi olarak ışınlanmış hücrelerde kümelenmiş DNA çift iplikli kırıklar gözlendi. İmmünofloresan boyamanın en önemli aşaması hücrelerin fiksasyonu ve hücre zarının permeabilizasyonudur.
Bu adımlar antikorların hem bu hücrelere hem de hücre içi onarım proteinlerine kolayca nüfuz etmesini sağlamak için gereklidir. Bu yordam, hücresel düzeyde her onarım yolunun aktivasyonu hakkında bilgi verir. Sonuçlar daha sonra gerçek zamanlı PCR gibi bir tahkikat kullanılarak moleküler düzeyde teyit edilmelidir.
Bu teknik, araştırmacıların radyasyona bağlı DNA hasar yanıtını keşfetmelerini mümkün kılmıştır, bu da antikanser tedavileri kullanılarak farklı ışınlarda tam olarak belirlenmemiştir.
