Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para detectar focos inducidos por radiación de proteínas de reparación mediante tinción de inmunofluorescencia en líneas celulares de cáncer de colon humano después de la irradiación con el haz mezclado con neutrones. Las imágenes de inmunofluorescencia son un método sensible y proporcionan evidencia visual para la aparición de proteínas de vía de reparación en focos en respuesta a agentes dañinos del ADN, como la radiación ionizante. El haz mezclado con neutrones se utiliza en la terapia de captura de neutrones de boro, BNCT, y la respuesta de daño del ADN inducida por radiación no se ha establecido completamente.
Nuestro protocolo también puede ser útil para el análisis de efectos biológicos a nivel celular debido a la radiación por otros haces de alta LET, como protones que utilizan terapia de haz de protones o iones de carbono utilizando la terapia de hadrones. Después de la irradiación, retire el medio de las células conectadas y lávelos una vez con 2,5 mililitros de PBS. Luego fije las células con un mililitro de 70% de etanol durante 10 minutos.
Para permeabilizar las células, retire el etanol y lávelos con 2,5 mililitros de PBS. Agregue suavemente un mililitro de 2%Tritón X-100 en PBS para cubrir los cubreobjetos, e incubar las células durante cinco minutos a temperatura ambiente. Lavar las células tres veces con PBS, y bloquear la permeabilización con un mililitro de 2%BSA diluido en PBS.
Luego incubar las células durante un mínimo de 30 minutos con el 2%BSA. Para manchar las células, agregue la cantidad adecuada de anticuerpo primario diluido en PBS con BSA, como se recomienda en el manuscrito de texto. A continuación, cubra el plato Petri y colóquelo en una caja de plástico con lignina hidratada para mantener la humedad.
Incubarlo durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, realice tres lavados con PBS y agregue la cantidad adecuada de anticuerpo secundario. Devuelva el plato a la caja de plástico con lignina hidratada e incubarlo durante al menos 30 minutos a 37 grados centígrados.
A continuación, repita los lavados con PBS, y agregue 100 microlitros de DAPI diluidos a una concentración final de un microgramo por mililitro para contrarrestar los núcleos. Incubar las células durante un máximo de dos minutos a temperatura ambiente, y repetir los lavados con PBS. Después del último lavado, retire el PBS y coloque suavemente un cubreobjetos en la parte superior del medio de montaje, evitando la formación de burbujas de aire.
Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas y deje que el medio de montaje se endurezca antes de realizar la microscopía de fluorescencia. Los focos Gamma-H2AX, que son marcadores estándar para roturas de doble cadena de ADN, se detectaron en células de cáncer de colon mezcladas con neutrones, irradiadas por haz y no irradiadas. Los focos aparecen como puntos fluorescentes distintos.
Se observó un diámetro más alto de los focos gamma-H2AX en las células irradiadas. Además, se detectó una sola pista de una partícula alfa de alta LET cruzando los núcleos. La microscopía de inmunofluorescencia se utilizó para detectar proteínas de reparación representativas Rad52 y proteína quinasa dependiente del ADN.
Se midió un valor medio alto del diámetro de los focos de proteína quinasa dependientes del ADN en las roturas de ADN después de la irradiación en comparación con las células de control. Se observaron roturas agrupadas de ADN de doble cadena en células irradiadas como focos más complejos, más grandes y agrupados con mayor intensidad. La etapa más importante de la tinción por inmunofluorescencia es la fijación de las células y la permeabilización de la membrana celular.
Estos pasos son necesarios para permitir que los anticuerpos penetren fácilmente tanto en esas células como en proteínas de reparación intracelulares. Este procedimiento proporciona información sobre la activación de cada vía de reparación a nivel celular. A continuación, los resultados deben confirmarse a nivel molecular mediante un ensayo, como la PCR en tiempo real.
Esta técnica permite a los investigadores explorar la respuesta al daño del ADN inducida por la radiación, que no se ha determinado completamente en el caso de diferentes haces que utilizan terapias contra el cáncer.
