تعد دراسة استجابة تلف الحمض النووي ضرورية لفهم الفيزيولوجيا المرضية للمؤشرات الحيوية المحتملة لسرطان المبيض في العلاج الموجه الجديد. تسمح هذه التقنية للعينة بالبقاء سليمة وتسمح بفحص مولدات الضد في موقع عملها. هذا البروتوكول سريع ويمكن تكييفه مع أي مستضد قابل للتألق المناعي.
تعطي هذه الطريقة نظرة ثاقبة لسرطان المبيض وعمليات إصلاح تلف الحمض النووي التي تنطوي عليها مقاومة مثبطات العلاج الكيميائي ومثبطات PARP. يمكن تطبيق هذه الأساليب على مجالات أخرى من الدراسة التي تنطوي على استخدام الثقافات 3D والمواد العضوية. للبدء ، استنشاق الوسائط من المواد العضوية المشععة والمحتضنة دون تعطيل مصفوفة 3D.
ثم يغسل مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إصلاح المواد العضوية في 300 ميكرولتر من 2 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق. بعد التثبيت ، اغسل المواد العضوية ب 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ وضعها على شاكر لمدة خمس دقائق.
ثم تتخلل العضو العضوي عن طريق إضافة 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية برفق. بعد 20 دقيقة من الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت واغسله ب 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ. ضع المواد العضوية على شاكر لمدة خمس دقائق.
بعد ذلك ، أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ لمنع خطوة النفاذية. ضعه على الخلاط لمدة 30 دقيقة ونضح المخزن المؤقت للتلطيخ باستخدام ماصة. ثم أضف 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في مخزن تلطيخ.
احتضان في أربع درجات مئوية لمدة 16 ساعة. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي. قم بإجراء ثلاث غسلات باستخدام 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ لمدة خمس دقائق لكل منها على شاكر.
أضف 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي المخفف في محلول تلطيخ ، واحتضانه لمدة ساعة واحدة في الظلام. بعد ساعة واحدة ، استنشق محلول الأجسام المضادة الثانوي وأضف 300 ميكرولتر من DAPI المخفف. ضع على شاكر لمدة خمس دقائق.
قم بإجراء ثلاث غسلات باستخدام 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ لمدة خمس دقائق لكل منها على شاكر. قم بإزالة المخزن المؤقت للتلطيخ وافصل الغرف باستخدام مجموعة الإزالة المرفقة مع شرائح الحجرة. اقطع طرف طرف ماصة P200 واستخدمه لإضافة وسيط تثبيت لتغطية كل بئر يحتوي على علامة تبويب عضوية.
ضع غطاء ينزلق فوق العينة مع تجنب الفقاعات. خذ طلاء الأظافر الشفاف وقم بطلائه على جوانب زجاج الغطاء لإغلاق الشريحة. اتركه يتصلب لمدة ساعة ثم ضعه عند 20 درجة مئوية.
التقط الصور باستخدام مجهر متحد البؤر باستخدام هدف 63X مع زيت الغمر. باستخدام هذا البروتوكول ، تم تلطيخ عضويات سرطان المبيض المشتقة من المريض بحثا عن بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي قبل وبعد التشعيع ، وتم تقييمها للمؤشرات الحيوية مثل جاما H2AX ، وهي علامة على تلف الحمض النووي ، و RAD51 ، وهي علامة لإصلاح إعادة التركيب المتماثل. كما تم تقييم RPA ، وهي علامة لإجهاد النسخ المتماثل ، و 53BP1 ، وهي علامة على الأمر غير المتماثل ، و Geminin ، علامة دورة خلية الطور GS2 باستخدام هذه التقنية.
تميل علامات تبويب BME إلى إزالة البلمرة ، لذا فإن إيلاء اهتمام وثيق بعد التثبيت والشفط أمر حيوي. يمكن أن يساعد تحليل المستضدات لتحديد تلف المواد العضوية والقدرة على تكوين استجابة لتلف الحمض النووي في تقييم مقاومة العلاج الكيميائي.
