هذا هو البروتوكول الأول لتوليد الخراجات الصفراوية، وتوفير تحليل منهجي يسمح بتقييم تكوين الكيس، والكفاءة، والحجم مع مرور الوقت. هذه الطريقة تسمح بالتقييم الكمي لتكوين كيس الظهارية، ويجعل من الممكن تقييم هذه العملية كدالة لنوع الخلايا الظهارية أو هيدروجيل. وبما أن الخيارات العلاجية للاضطرابات الصفراوية محدودة، فإن هذا البروتوكول يفتح الباب لتوحيد دراسات الأدوية، وتحديد الأهداف العلاجية العادية، وفهم آليات المرض.
الأسلوب بسيط يسمح معالجة أسئلة هامة حول آليات المعلومات الجديدة في مجال الهندسة الحيوية للهياكل أنبوبي. قبل البدء في تجربة، ذوبان محلول هيدروجيل المناسبة في أربع درجات مئوية وقبل تهدئة نصائح ماصة وثمانية شريحة غرفة بئر في ناقص 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، ووضع هيدروجيل وثمانية شريحة غرفة بئر على الجليد وإضافة حجم مناسب من هيدروجيل إلى كولانجيوسيكيت الفئران العادية الباردة المتوسطة كاملة للحصول على 500 ميكرولترات من 40٪ حل هيدروجيل.
ثم استخدام نصائح ماصة الباردة لإضافة 50 ميكرولترات من محلول هيدروجيل إلى مركز كل بئر من الشريحة الغرفة واستخدام تلميح ماصة لنشر الحل على سطح كامل من أسفل البئر بالتساوي قدر الإمكان دون فقاعات. لإعداد الخلايا للتجربة ، في حين أن الهيدروجيل هو البلمرة ، وغسل الخلايا من 70 ٪ التقاء الجرذان الطبيعية ثقافة cholangiocyte مع برنامج تلفزيوني قبل الدافئة واحتضان الخلايا مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد قبل الدفء لمدة 20 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية. في نهاية الحضانة، استبدال برنامج تلفزيوني مع ملليلتر واحد من التربسين-EDTA قبل warmed وإعادة القارورة إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة خمس إلى 10 دقائق.
عندما تكون الخلايا قد فصلت، تحييد التفاعل مع أربعة ملليلتر من قبل الدافئة كاملة فئران طبيعية 15 100000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ثم إعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من المتوسطة قبل الدافئة وتصفية الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرون في أنبوب 50 ملليلتر للعد. لتوليد الخراجات، إضافة حجم المناسبة من هيدروجيل إلى الباردة كاملة طبيعية الفئران cholangiocyte المتوسطة للحصول على 1، 600 ميكرولترات من محلول هيدروجيل 80٪ على الجليد وتمييع الخلايا إلى خمس مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من الباردة كاملة فئران طبيعية cholangiocyte تركيز متوسط في 1، 600 ميكرولترات المتوسطة.
على الفور مزيج الخلية والحلول الخلية hydrogel وإضافة 400 ميكرولترات من الخلايا إلى كل بئر من شريحة غرفة المائية المغلفة، مع الحرص على تجنب فقاعات. لضمان الحصول على نتائج قابلة للاستنساخ وكبيرة، تأكد من التعامل مع هيدروجيل بعناية وخلط شامل حل الهيدروجين الخلية الأولية للحصول على حل متجانس. عندما تم بذر كافة الخلايا، ضع الشريحة في حاضنة ثقافة الخلية.
بعد يومين في الثقافة، وإزالة 250 ميكرولترات من المتوسط من زاوية واحدة من كل بئر، مع الحرص على عدم طرد الهيدروجيل، واستبدال ببطء supernatant المهملة مع 250 ميكرولترات من وسط ثقافة جديدة. لتصوير الكيس، في اليوم المناسب للثقافة، حدد الهدف 10 X على مجهر النقيض المرحلة مجهزة برنامج الحصول على الصور، والتبديل على مصباح أبيض وحدد الخيار التصوير brightfield. حدد اللعب للتبديل على الكاميرا والتركيز على حقل من الخراجات.
تعيين وقت التعرض وفتح نافذة مجلد التقاط السيارات للسماح الحفظ التلقائي للصور. فتح نافذة التقاط سلسلة Z، وإعادة تعيين الموقف الافتراضي واستخدام Z-المسمار لتحديد السهول العليا والسفلية من المكدس Z، وضبط Z-الخطوة اعتمادا على الهدف ومستوى القرار. ثم انقر فوق تشغيل الآن لإطلاق الاستحواذ.
بعد التصوير، افتح مكدس Z في فيجي. لتكرار المكدس، انقر فوق صورة، ومكررة، ومكرّرة. لإنشاء إسقاط الحد الأدنى من كثافة من المكدس المكرر، ضمن قائمة الصور، حدد مكدسات ومشروع Z.
حدد الحد الأدنى من الكثافة لنوع العرض وانقر فوق Okay. لطرح الخلفية من الإسقاط، تحت القائمة العملية، حدد طرح الخلفية وحدد 500 بكسل من نصف قطر الكرة المتداول والخلفية الخفيفة لجعل الخراجات أكثر تباينا من الخلفية. لقياس قطر الكيس التقريبي، قم بتكبير الكيس المستهدف، وحدد أداة الخط المستقيم واضغط على الزر T على لوحة المفاتيح.
رسم خط عبر قطر كل كيس على الإسقاط النهائي. سيتم إضافة المنطقة التالية من الفائدة التي تم إنشاؤها لكل كيس إلى المنطقة من مدير الفائدة. عندما تم عد جميع الخراجات، انقر على نافذة Z-المكدس لتحديده وانقر فوق إظهار جميع لرؤية الخراجات عد.
نقل المؤشر على طول Z-المكدس للتحقق من أن جميع الخراجات قد تم عدها في كل صورة، مضيفا الخراجات الجديدة إلى المنطقة من مدير الفائدة حسب الضرورة. عندما تم عد جميع الخراجات، حدد المنطقة من مجموعة الفائدة وانقر فوق أكثر وحفظ لحفظ البيانات. لتحديد حجم كل كيس، مع مناطق الاهتمامات المحددة لا يزال، انقر فوق قياس.
ستظهر نافذة تسرد كل كيس وحجمه المقدر. ثم احفظ البيانات بتنسيق CSV. كما هو موضح، تسجيل عدد من الخراجات وأحجامها على حدة مع مرور الوقت يسمح بتحليل تطور تكوين الكيس والنمو.
يمكن تقييم صلاحية مجموعة الخلايا التي تبدأ والخراجات القديمة لمدة 10 أيام من خلال التلطخ الحي/ الميت. الخلايا الميتة تمثل أقل من 3٪ من عدد الخلايا في اليوم 10 وتقع في الغالب خارج الكيس كخلايا معزولة أو كجزء من مجاميع صغيرة، على الرغم من أن بعض تراكم حطام الخلايا النخرية لوحظ داخل بعض الخراجات الكبيرة. الحضانة مع diacetate Fluorescein وهويشت يسمح تقييم تشكيل وإفراز الفلوريسين من القاعدية إلى الفضاء اللمعان apical.
وتجدر الإشارة إلى أن إفراز الفلورسين يثبطه العلاج المسبق بمثبط مقاوم للأدوية المتعددة، مما يشير إلى أن تراكم الفلورسين في تجويف التجويف يرجع إلى إفرازه من خلال الناقل المقاوم للأدوية المتعددة وليس التسرب من الفضاء بين الخلايا. التلوين للتعبير E-cadherin يكشف عن أن الفئران cholangiocytes العادية الحفاظ على النمط الظاهري الظهارية في الهيدروجيل لمدة 10 أيام على الأقل. عند إعداد الخراجات لتقييم المناعةfluorescence، والحفاظ على الألبومين المصل البقري في 0.1٪ أو أقل خلال التشبع هو المفتاح للحفاظ على سلامة الكيس، كما يؤدي تركيزات أعلى في سحب الكيس وانهيار التجويف.
بين عشية وضحاها هيدروجيل، ذوبان، تلميح ماصات وتسجيل الشريحة الغرفة، والعمل على الجليد ونشر خليط هيدروجيل الخلية متجانسة بشكل موحد على الشريحة غرفة مثقف كلها حاسمة للنجاح التجريبي. يمكن استخدام هذه الطريقة لتوليد الخراجات من الخلايا الظهارية الأخرى أو الهيدروجيلس، مما يسمح بالمقارنة من أجل فهم أفضل لاستقطاب الظهارية. ويمكن استخدام هذه الطريقة الكمية لاختبار آثار المخدرات أو الطفرات الجينية على وظيفة الصفراوية ونشأة الأعضاء.
