نقاط الاشتباك العصبي هي العناصر الوظيفية للخلايا العصبية وعيوبها أو خسائرها هي في أساس العديد من الاضطرابات العصبية والعصبية. وتستخدم على نطاق واسع دراسات التصوير للتحقيق في وظيفتها واللدونية في الظروف الفسيولوجية والمرضية. بسبب حجمها وهيكلها، تتطلب دراسات توطين البروتينات تقنيات تصوير عالية الدقة.
في هذا البروتوكول، نحن وصف إجراء لدراسة في الخلايا العصبية الأولية التعريب المشترك للبروتينات المستهدفة مع علامات متشابك على مستوى فائقة الدقة باستخدام المجهر الإضاءة منظم. SIM هي تقنية إضاءة ضوئية منقوشة تضاعف الدقة المكانية للمجهر العريض ، لتصل إلى تفاصيل حوالي 100 نانومتر. يشير البروتوكول إلى عناصر التحكم والإعدادات المطلوبة لإجراء دراسات قوية للترجمة المشتركة ونظرة عامة على الأساليب الإحصائية لتحليل بيانات التصوير بشكل صحيح.
بيد أن مفتاح السماح بإجراء التحليل على مستوى فائق الاستبانة هو الكواشف المستخدمة أثناء الاقتناء، مثل الأغطية المغطّاة بحجرات وحلول التركيب المتوافقة مع مؤشر الحيود للهدف. للحصول على العصبون العصبية الأولية فرس النهر الماوس، عزل فرس النهر من P1 إلى P4 الجراء. خلايا الصفيحة في 70،000 الخلايا في بئر في حجم 200 ميكرولترات في البئر.
الانتظار حتى يتم نضج الخلايا العصبية الأساسية فرس النهر تماما 12 إلى 14 يوما بعد الطلاء لإجراء دراسات التعريب المشترك. إضافة 4٪ paraformaldehyde، PFA، في برنامج تلفزيوني 200 ميكرولترس في بئر إلى الخلايا العصبية لإصلاحها بسرعة. إزالة الحل واحتضان العينات مع 1٪ من البوم المصل البقري، BSA، في برنامج تلفزيوني في 200 ميكرولترس في البئر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لتغطية بشكل سلبي جميع الأسطح المجانية الربط من لوحة مع بروتين غير ذي صلة للتحليل.
يقلل حاجز الحجب القائم على BSA بدون Triton X-100 من خلفية الأجسام المضادة بكفاءة أكبر من نفس المخزن المؤقت مع 0.2٪ Triton X-100. إضافة الأجسام المضادة الأساسية. كتحكم سلبي، لا تضيف أي جسم مضاد أساسي إلى أحد الآبار.
خلايا جبل باستخدام mountant SIM المتوافقة، على سبيل المثال ProLong زجاج Antifade Mountant. تغطية وحماية الخلايا مع غطاء زجاجي، على سبيل المثال، غلاف دائري مع قطر ثمانية ملليمترات.
ويمكن أيضا أن تكون تلك المربعة المستخدمة. تخزين الأغطية الغرف في درجة حرارة الغرفة والانتظار على الأقل 48 ساعة قبل الحصول على الصور. يتطلب زجاج الألماس يومين على الأقل من العلاج قبل عمليات الاستحواذ فائقة الدقة.
استخدم استراتيجيتين لضمان خصوصية الأجسام المضادة. الأول هو استخدام ما لا يقل عن اثنين من الأجسام المضادة المختلفة التي تستهدف نفس الركيزة. الاستراتيجية الثانية هي تحييد الأجسام المضادة عن طريق الحضانة مع الهدف البروتين المنقى، أو المستخدمة لرفع الأجسام المضادة.
نحن نستخدم بشكل روتيني مجهر فائق الدقة من N-SIM الذي تصنعه نيكون لتحليلنا. الإرشادات التالية هي أن تكون مخصصة للحصول على صور SIM بشكل مستقل عن مجهر الاستخدام. من المهم أيضا لتحقيق أقصى قدر من أداء المجهر لإجراء معايرة دقيقة من الصكوك، بما في ذلك حلقة التصحيح، محاذاة الليزر، والتركيز كتلة صريف.
قبل الحصول على صور SIM ، يتطلب النظام معايرة مناسبة مع حبات فلورية ذات حجم دون دقة محددة. ومن الأمثلة على ذلك مصغرة رباعية التفرعات. هذه الخرز ملطخة بأصباغ فلورية مختلفة للسماح بمعايرة أشعة الليزر المختلفة مع عينة واحدة.
في حمام مائي، sonicate حوالي 1.8 مرات 10 إلى 8 الفلورسنت microspheres لمدة 10 دقائق. تمييع الفلورسنت microspheres واحد من كل 500 في الماء المقطر مزدوجة. سونيكات للمرة الثانية لمدة 10 دقائق إضافية.
الماصات 15 ميكرولترات من الخرز المخفف في بئر من غطاء الحجرة. اسمحوا الحل الجاف لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 10 ميكرولترات من حل تصاعد، على سبيل المثال.
برولونغ زجاج، ووضع غطاء ثمانية ملليمتر على القمة. انتظر 48 ساعة على الأقل للسماح بالمعالجة المناسبة. بدوره على المجهر وأشعة الليزر.
دع النظام يسخّن للوصول إلى التوازن الحراري لجميع مكونات المجهر ويتطلب نظام المجهر فائق الدقة SIM ثلاث ساعات على الأقل. حدد الهدف 100X. بدء المعايرة عن طريق محاذاة أشعة الليزر إلى مركز كتلة صرع الحيود.
في نظام N-SIM، يسمح مقبض ميكرومتر وكاميرا مخصصة بتمركز الحزم الضوئية إلى الهدف. أدخل غطاء الأغطية المغطى بالحجرة من المجهر للعرض. تعيين النظام إلى سمك غطاء الغرف عن طريق ضبط غطاء التصحيح الموضوعي.
NIS Software، وهو برنامج مملوك مزود بأنظمة مجهرية فائقة الدقة من نوع N-SIM، له وظيفة تلقائية لتنظيم تصحيح الألوان. ضبط تركيز كتلة الصريف لكل قناة لضمان تركيز الإضاءة نمط منظم على العينة. يوفر البرنامج وظيفة تلقائية لهذه المهمة.
الحصول على صور SIM 3D الخام من microspheres متعددة الألوان. حساب لكل طول موجي منفصل تحويل فورييه للصورة فائقة الحل. إذا فشلت الصورة المحولة في الحصول على نمط مثل الزهور الصحيح، إعادة تشغيل المعايرة منذ لم يتم تحقيق فائقة الدقة.
في الصورة فائقة الحل، حدد ميكروسير واحد وحساب ملفه الشخصي كثافة لكل قناة لقياس دقة التي تحققت. وينبغي أن يكون الآن على مقربة من 100 نانومتر في وقت لاحق. تنفيذ تسجيل القناة عن طريق تراكب اقتناء متعدد القنوات من microspheres.
والهدف هو أن collimate جميع إشارات القناة بشكلٍ مُشَرَق وبديهي. هذا سوف القضاء على الانحرافات لوني بسبب عدم محاذاة القنوات المختلفة ويساعد على تحليل التعريب المشترك. تأكيد جودة المعايرة باستخدام وظائف مرحلة الإضاءة خطوة والإضاءة نمط التركيز من SIMcheck، مجموعة من الإضافات لتطبيق المصدر المفتوح ImageJ.
ابدأ في تحليل العينة باستخدام هدف 40X في وضع confocal أو widefield. هذا يسمح الملاحة من العينة، والحفاظ على التفاصيل الجيدة ومجال كبير من الرؤية. استخدم إشارة الأجسام المضادة MAP2 للكشف عن منطقة تمثل العمليات العصبية.
الحصول على صور للعينة في وضع confocal لتحديد نوعية تلطيخ. التحول إلى الهدف 100X. تطبيق النفط على الهدف 100X.
الحصول على صورة واسعة أو confocal التي سيتم استخدامها في وقت لاحق لتقييم جودة الصورة فائقة حل. التبديل إلى وضع SIM ثلاثي الأبعاد. باستخدام إطارات الحوار لتعيين معلمات الحصول على، حدد أعلى إعداد عمق بت المتوفرة لزيادة معلومات اللون إلى أقصى حد.
عادةً، 16 بت هو الخيار القياسي. وعلاوة على ذلك، لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، حدد قيمة التردد المنخفض للاستحواذ، مثل ميغاهرتز واحد. باستخدام النوافذ المدرج التكراري، تعيين قوة الليزر للحصول على استجابة خطية من إشارة لتجنب فقدان المعلومات، والحد من بكسل المشبعة في الصور.
يستخدم نظام N-SIM كاميرا أندور iXon3. عند العمل عند 16 بت، اختر شدة الهدف من 16،000 لضمان استجابة خطية للكاميرا. وبدلاً من ذلك، اختر نطاقًا يتراوح بين 30،000 إلى 45،000 لتعظيم النطاق الديناميكي لعمليات الاستحواذ.
تعيين قوة الليزر بين 0.1٪ و 50٪ عند تصوير العينات وأوقات التعرض بين 50 مللي ثانية وثانيتين. قد القوى الليزر فوق 50٪ يسبب photobleaching سريع من الفلوروفوريس في الاستخدام. ابدأ في الحصول على الصور في وضع SIM ثلاثي الأبعاد.
استخدم SIMcheck ، وهو عبارة عن مجموعة من الإضافات المجانية لـ ImageJ ، لتقييم جودة عمليات الاستحواذ على الصور الخام. إذا لم يكشف SIMcheck عن أي آثار أو مشكلات تتعلق بالجودة، احصل على 10 صور على الأقل من النسخ المتماثلة التقنية الكاملة للسماح بإجراء تحليل إحصائي. الصور المكتسبة هي بيانات أولية تحتاج إلى معالجة للحصول على صور SIM المعاد بناؤها التي سيتم استخدامها لمزيد من التحليل.
في البروتوكول، نقترح استخدام synaptophysin و PSD-95 كعلامات ما قبل وما بعد متشابك. ومع ذلك، يمكن استخدام علامات إضافية. وهناك مجموعة ضخمة من الأدب يدعم استخدام البروتينات الأخرى، مثل drebrin وباسون كعلامات متشابك.
صور 3D SIM المكتسبة هي الصور الخام التي تحتاج إلى معالجة للحصول على إعادة بناء فائقة حل الصور. إعادة بناء غير صحيحة من الصور الخام يمكن أن يؤدي إلى القطع الأثرية التي من شأنها أن تؤثر على تحليل العينات. ولذلك ينبغي إيلاء اهتمام كبير لاختيار معايير إعادة الإعمار على النحو الصحيح.
معالجة الصور الخام باستخدام برنامج تحليل إعادة بناء المجهر للحصول على صورة فائقة الحل. بدلا من ذلك ، استخدم البرنامج المساعد ImageJ المتاحة مجانا fairSIM لإعادة بناء الصور الخام. حساب فورييه تحويل الصور فائقة حل باستخدام برنامج إعادة بناء المجهر أو ImageJ البرنامج المساعد SIMcheck.
يجب أن تعود صورة جيدة أعيد بناؤها ، لكل قناة ، صورة تشبه الزهرة. إذا فشلت الصور المعاد بناؤها في إعادة إنشاء شكل يشبه الزهرة، قم بإعادة التشغيل من الصور الخام وإعادة بنائها عن طريق تعديل معلمات إعادة البناء، مثل التصفية الخطية، والبوديبل، وإلغاء ترتيب الصفر. في NIS Software باستخدام المعاينة لمراقبة كيفية تأثير تغيير المعلمات على الصورة النهائية التي تم حلها، قم بتعديل تباين تعديل الإضاءة الخاص بالمعلمة، ومنع الضوضاء عالية الدقة، والخروج من التركيز.
تحليل الصورة المعاد بناؤها للكشف عن القطع الأثرية بشكل غير متحيز باستخدام NanoJ-SQUIRREL ، وهو مكون إضافي يستند إلى ImageJ ، لتقييم جودة الصور فائقة الحل. في تحليلنا للتوطين المشترك، استخدمنا نهجين. الأول هو نهج مرئي يستند إلى تحليل الملف الشخصي الذي يظهر أحداث فردية للتعريب المشترك ويحدد مساهمة كل قناة.
كخطوة أولى لدراسة التعريب المشترك بين علامات متشابكة والبروتين من الفائدة، واتخاذ صورة فائقة حل وتحليل مكان واحد لتحديد تداخل إشارة. تحديد موضع واحد على الصورة فائقة الحل. الحصول على ملامح كثافة الإشارات الفلورية إلى موضع الاهتمام.
إذا كان تحليل الملف الشخصي قد اقترح توطينًا مشتركًا في الملوس الواحد ، فيمكن إجراء تحليل أكثر عمومية للصورة بأكملها عن طريق حساب معاملات Pearson و Mander. استخدم JACoP ، وهو مكون إضافي لـ ImageJ ، لتحديد معلمتين للتعريب المشترك ، بيرسون وماندر. بعد معايرة النظام وتقييم جودة الصور المعاد بناؤها ، بدأنا بعد ذلك في تحليل الثقافات العصبية الأولية الملطخة باجسام مضادة ضد MAP2 ، علامة عصبية ، PSD-95 ، علامة ما بعد الطمث ، وهدفنا بروتين SUMO1.
قمنا أولا بتحليل العينة التي تقوم بإجراء المجهر confocal أربع قنوات مع هدف 40X. عند اختيار منطقة تمثل العمليات العصبية، انتقلنا إلى هدف 100X. لقد حصلنا على صور confocal و SIM لنفس المنطقة لتقييم جودة إعادة الإعمار مع NanoJ-SQUIRREL وإجراء تحليل التعريب المشترك.
إن توضيح بنية وتكوين المشبك أمر بالغ الأهمية لفهم العمليات الفسيولوجية والمرضية على حد سواء التي تنظم الذاكرة والإدراك. بينما في حالة العادية نقاط الاشتباك العصبي هي اللبنات الأساسية للذاكرة، كما أنها هي في أساس الاضطرابات العصبية المعقدة، مثل واحدة من الأشكال الأكثر شيوعا من مرض الزهايمر الخرف. البروتوكول الموصوف هنا يسمح بدراسة تكوين البروتين من نقاط الاشتباك العصبي مع تقنية المجهر فائقة الدقة تسمى المجهر الإضاءة المنظم.
