シナプスはニューロンの機能要素であり、その欠陥または損失はいくつかの神経変性疾患および神経疾患の基礎にある。画像化研究は、生理学的および病理学的状態におけるその機能および可塑性を調べるのに広く使用されている。タンパク質のサイズと構造のため、タンパク質のローカリゼーション研究には高解像度イメージング技術が必要です。
本プロトコルでは、構造化された照明顕微鏡を用いて、シナプスマーカーを用いた標的タンパク質のシナプスマーカーの共局在化を一次ニューロンで研究する手順を説明する。SIMは、広視野顕微鏡の空間分解能を2倍にするパターン化された光照明技術で、約100ナノメートルのディテールに達します。このプロトコルは、堅牢な共局化研究に必要な制御と設定、およびイメージングデータを適切に分析するための統計的手法の概要を示します。
しかし、超解像レベルで解析を可能にする鍵は、チャンバーカバーリップや目的の回折指数と互換性のある取り付けソリューションなど、取得中に使用される試薬です。マウス海馬の一次ニューロンを得るために、P1からP4子犬に海馬を分離する。プレート細胞はウェルあたり200マイクロリットルの体積でウェルあたり70,000細胞当たり。
海馬の一次ニューロンが完全に成熟するまで待ちます 12 から 14 共局在の研究を実行するためにメッキ後 12 〜 14 日.4%パラホルムアルデヒド、PFA、PBSで200マイクロリットルをニューロンに加え、迅速に固定します。溶液を取り除き、PBSで1%ウシ血清アルブミン、BSA、PBSで室温で1時間、PBSでサンプルをインキュベートし、分析のために無関係なタンパク質でプレートのすべての自由結合表面を受動的に覆います。
トリトンX-100のないBSAベースのブロッキングバッファーは、0.2%Triton X-100と同じバッファーよりも効率的に抗体の背景を減少させます。一次抗体を追加します。陰性対照として、一次抗体を一つのウェルに添加しないでください。
SIM対応のマウントを使用してセルをマウントします(例えばProLongグラスアンチフェードマウンタント)。例えば、直径8ミリメートルの丸いカバーグラスなど、カバーグラスで細胞を覆い保護します。
正方形のものも使用できます。室温でチャンバーカバーリップを保存し、画像を取得する前に少なくとも48時間待ちます。ダイヤモンドグラスは、超分解能の獲得前に少なくとも2日間の硬化を必要とします。
抗体特異性を保証するために2つの戦略を使用してください。第1の1つは、同じ基質を標的とする少なくとも2つの異なる抗体を用いる。第2の戦略は、精製タンパク質標的とのインキュベーションによる抗体中和、または抗体を上昇させるために使用される抗体です。
ニコン製のN-SIM超分解能顕微鏡を解析に日常的に使用しています。以下の手順は、使用顕微鏡とは無関係にSIM画像を取得することを目的としています。また、補正リング、レーザーアライメント、グレーティングブロックの焦点合わせなど、機器の正確なキャリブレーションを実行するために、顕微鏡の性能を最大限に高めることも重要です。
SIM画像を取得する前に、システムは特定のサブ解像度サイズの蛍光ビーズを適切にキャリブレーションする必要があります。例としては、テトラスペック微小球があります。これらのビーズは、1つのサンプルで異なるレーザーのキャリブレーションを可能にするために、異なる蛍光色素で染色されています。
水浴では、10分の8番目の蛍光微小球に1.8回程度超音波処理します。蛍光微小球を500分の1に希釈し、二重蒸留水で使用します。さらに10分間2回目のソニッケートを行います。
希釈されたビーズのピペット15マイクロリットルは、チャンバーカバースリップの井戸に入った。溶液を室温で5分間乾燥させます。取り付け溶液の10マイクロリットルを追加します。
ProLongグラス、上に8ミリメートルのカバースリップを置きます。適切な硬化を可能にするために少なくとも48時間待ちます。顕微鏡とレーザーをオンにします。
システムがすべての顕微鏡コンポーネントの熱平衡に達するために暖かくさせ、SIM超解像顕微鏡システムは少なくとも3時間を必要とします。100X の目標を選択します。レーザーを回折格子ブロックの中心に合わせて調整を開始します。
N-SIMシステムでは、マイクロメーターノブと専用カメラを使用して、光線をターゲットにセンタリングできます。顕微鏡のチャンバーカバースリップを挿入して、観察します。客観的な補正カバーを調整することにより、チャンバーカバースリップの厚さにシステムを設定します。
NISソフトウェアは、N-SIM超解像顕微鏡システムで提供される独自のソフトウェアで、色の補正を調節する自動機能を備えています。各チャンネルのグレーティングブロックフォーカスを調整して、サンプルに焦点を合わせて構造化されたパターン照明を確保します。ソフトウェアは、このタスクの自動機能を提供します。
多色微小球の生の3D SIM画像を取得します。超分解画像のフーリエ変換を別々の波長ごとに計算します。変換された画像が正しい花のようなパターンを得られない場合は、超解像度が達成されていないので、キャリブレーションを再開します。
超解決イメージでは、1 つのマイクロスフィアを選択し、各チャネルの強度プロファイルを計算して、達成した解像度を測定します。それは今横に100ナノメートルに近いはずです。マイクロスフィアのマルチチャンネル集録をオーバーレイして、チャンネル登録を行います。
目標は、すべてのチャンネル信号を横に、軸に合致することです。これは異なったチャネルのずれによる色収差を除去し、共局在分析を助ける。オープンソースアプリケーションImageJのためのプラグインのスイートであるSIMcheckの機能照明段階ステップと照明パターンフォーカスを使用してキャリブレーションの品質を確認します。
共焦点またはワイドフィールドモードで40Xの目的を使用してサンプルの分析を開始します。これにより、サンプルのナビゲーションが可能になり、良好な詳細と大きな視野を維持できます。MAP2抗体シグナルを使用して、ニューロンプロセスを表す領域を検出します。
共焦点モードでサンプルの画像を取得し、染色の品質を決定します。目的 100X に切り替えます。100Xの目的に油を適用します。
超解決イメージの品質を評価するために後で使用されるワイドフィールドまたは共焦点イメージを取得します。3D SIM モードに切り替えます。ダイアログ ウィンドウを使用して取得するパラメーターを設定し、色情報を最大化するために使用可能な最高のビット深度設定を選択します。
通常、16 ビットが標準の選択肢です。また、信号対雑音比を向上させるために、1メガヘルツなどの低周波値を選択して取得します。ヒストグラムウィンドウを使用して、レーザーパワーを設定して、情報の損失を避けるために信号の線形応答を得、画像内の飽和ピクセルを制限します。
N-SIMシステムは、アンドーiXon3カメラを使用しています。16 ビットで作業する場合は、カメラの線形応答を確保するために、目標の強度 16,000 を選択します。または、30,000~45,000の範囲を選択して、集録のダイナミックレンジを最大化します。
サンプルをイメージングする場合はレーザーパワーを0.1%~50%、露光時間を50ミリ秒から2秒に設定します。50%を超えるレーザーパワーは、使用中の蛍光色素の急速な光の漂白を引き起こす可能性があります。3D SIMモードで画像の取得を開始します。
SIMcheck、ImageJ用の無料プラグインのスイートを使用して、生画像の取得の品質を評価します。SIMcheck がアーティファクトや品質の問題を検出しない場合は、統計分析を可能にするために、完全な技術複製から最低 10 個の画像を取得します。取得した画像は、さらなる分析に使用される再構築されたSIM画像を取得するために処理する必要がある生データです。
プロトコルでは、シナプトフィシンとPSD-95をシナプス前および後シナプスマーカーとして使用することを提案する。ただし、追加のマーカーを使用できます。巨大な文献体は、シナプスマーカーとしてのデブリンやファゴットなどの他のタンパク質の使用をサポートしています。
3D SIM取得画像は、再構成された超解決画像を取得するために処理する必要がある生の画像です。生画像の誤った再構成は、サンプルの分析に影響を与えるアーティファクトにつながる可能性があります。したがって、再構成パラメータを適切に選択するには、大きな注意を払う必要があります。
顕微鏡再構成解析ソフトウェアを用いて生画像を処理し、超解決画像を得る。あるいは、自由に利用できる ImageJ プラグイン fairSIM を使用して、生のイメージを再構築します。顕微鏡再構成ソフトウェアまたは ImageJ プラグイン SIMcheck を使用して、超解決画像のフーリエ変換を計算します。
良い再構築された画像は、各チャンネルのために、花のような画像を返す必要があります。再構築されたイメージで花のような形状を再現できない場合は、生の画像から再開し、リニア フィルタリング、アポダイゼーション、ゼロ オーダー抑制などの再構築パラメータを変更して再構築します。NISソフトウェアでは、プレビューを使用してパラメータの変更が最終的な解決されたイメージに与える影響を監視し、パラメータの照明変調コントラスト、高解像度ノイズ抑制、および焦点外抑制を変更します。
再構築された画像を解析し、ImageJベースのプラグインNanoJ-SQUIRRELを使用して、超解決画像の品質を評価することで、アーチファクトを公平に検出します。共局在化の分析では、2つのアプローチを用いた。1 つ目は、共同ローカリゼーションの単一イベントを示し、各チャネルの貢献度を識別するプロファイル分析に基づく視覚的アプローチです。
シナプスマーカーと目的タンパク質の共同局在化を研究する最初のステップとして、超分解画像を取り、単一の軌跡を分析してシグナルの重複を判断します。超解決画像上の単一の軌跡を識別します。目的の軌跡に蛍光シグナルの強度プロファイルを取得します。
プロファイル分析で単一の遺伝子座の共局在化が示唆されている場合、ピアソンとマンダーの係数を計算することで、画像全体のより一般的な分析を行うことができます。JaCoP、ImageJプラグインを使用して、共局化の2つのパラメータ、ピアソンとマンダーのパラメータを決定します。システムを較正し、再構築された画像の品質を評価した後、MAP2、ニューロンマーカー、PSD-95、ポストナプティックマーカー、および標的タンパク質SUMO1に対する抗体で染色された主要な神経細胞培養の分析を開始しました。
まず、40Xの目的で4チャンネル共焦点顕微鏡を行うサンプルを分析しました。神経のプロセスを表す領域を選択すると、100Xの目標に切り替えました。同じ領域の共焦点画像とSIM画像を両方取得し、NanoJ-SQUIRRELで再構築の質を評価し、共局在解析を行いました。
シナプスの構造と組成を解明することは、記憶と認知を調節する生理学的および病理学的プロセスの両方を理解するために重要である。正常な状態ではシナプスは記憶の構成要素であるが、それらはまた、認知症アルツハイマー病の最も一般的な形態の一つのような複雑な神経疾患の基礎にある。ここで説明するプロトコルは、構造化照明顕微鏡法と呼ばれる超解像顕微鏡技術を用いたシナプスのタンパク質組成の研究を可能にする。
