この研究は、NIH(1R35GM133496-01)からZ.ガオへの助成金によって支えられた。ライアン・ホッブス博士の切り離し支援に感謝します。ペン州立医科大学の中核施設(ゲノム科学とバイオインフォマティクス、先端光顕微鏡イメージング、フローサイトメトリーなど)に感謝します。また、今村有香先生のRNA-seq解析のお手伝いに感謝します。

1. mESC文化
<ol><li>10 cmの組織培養処理プレートに0.1%のゼラチンをコーティングし、ゼラチンを少なくとも15〜30分間セットしてから吸い出します。</li>
	<li>種子γ照射マウス胚性線維芽細胞(MEF)は、予め温めたmESC培地(Dulbeccoの改変イーグル培地(DMEM)に15%の胎児ウシ血清(FBS)、非必須アミノ酸を含むMESCを培養する前日に、 β-メルカプトエタノール、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、LIF、PD0325901(PD)、およびChir99021(CH))</li>
	<li>e14細胞を培養する前に、γ照射されたMEFをプレート表面に沈着させます。</li>
	<li>37 °Cの水浴でE14 ESCを解凍し、すぐに暖かいmESC媒体と15 cmの円錐形の管の細胞を移す。細胞を200xgで3分間ペレットし、上清を取り除きます。</li>
	<li>細胞をmESC培地の10mLに再懸濁し、先に播種したγ照射されたMEFを含む培養プレート上の細胞をプレートに入れた。5%CO2未満の37°Cインキュベーターで細胞培養をインキュベートする。</li>
	<li>培養パスケージングの場合、培地を吸引し、滅菌1xPBSでプレートを洗浄する。プレート表面を覆うのに十分な0.05%のトリプシンを加え、37°Cで3分間インキュベートします。</li>
	<li>mESC培地とピペットでトリプシンを中和し、単一細胞懸濁液を生成します。細胞を200xgで3分間遠心し、上清を取り除きます。</li>
	<li>血球計または細胞カウンターで細胞を数え、10cm培養プレートに約5.0 x105個 の細胞を播種します。</li>
	<li>細胞をmESC培地の10mLに再懸濁し、先に述べたようにゼラチンコーティングされた組織培養プレート上の細胞をプレートし、培養をインキュベートする。 注: 細胞がコロニー内で分化するのを防ぐために、mESC を 2 日ごとに通過させることが推奨されます。フェノール赤は、pHインジケーターとしてのみ機能し、細胞密度に応じて、2日よりも早く黄色(より酸性)に変えることができます。したがって、毎日培地を変更する必要があるかもしれません。γ照射されたMEFは、いくつかの通路の後に最終的に死ぬでしょう。</li>
</ol>2. EB、NPC、およびニューロンの分化
<ol><li>前述のカルチャパスパサイジング プロトコルを実行し、セルをカウントします (手順 1.7 ~ 1.10)。</li>
	<li>ぶら下げ方法 (日 0)<ol>
<li>10cmの細胞培養プレートの場合、5.0 x 102細胞が20μL分化培地(15%FBS、非必須アミノ酸、βメルカプトエタノール、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピロビン酸を含むDMEM)に懸濁する約2.5 x 104細胞を数えます。細胞を含む約502μLの液滴は、10cmのプレートにメッキすることができる。</li>
		<li>適切な数の細胞をアリコートし、次いで細胞を200xgで3分間遠心し、上清を除去する。</li>
		<li>細胞密度5.0 x 102細胞 /20μL(例えば、分化培地1mLの2.5 x104細胞 )の適切な分化培地の細胞を再懸濁する。</li>
		<li>マイクロピペットまたはリピータピペットを使用して、細胞懸濁液の20μL液滴を組織培養プレートの蓋上に置く。液滴が互いに近すぎないようにして、液滴がマージされないようにします。 注:液滴は、プレート自体ではなく蓋の上に置かれるので、組織培養処理された取り付けプレートまたはサスペンションプレートのいずれかにメッキすることができます。より実現可能で無菌のアプローチのために、液滴を付着組織培養プレートにプレートし、以下に説明するように懸濁液プレートに移します。</li>
		<li>1x PBSの5~10 mLでプレートを満たし、蓋を慎重にプレートに戻します。培養液を37°Cインキュベーターで培養します。 注:PBSは、液滴が乾燥するのを防ぐために培養プレートに添加されます。</li>
	</ol></li>
	<li>2日目には、マイクロピペットを使用して蓋から液滴を回収し、10mLの分化培地で満たされた10cmの細胞培養懸濁液板に入れます。インキュベーターで低速で揺れる軌道シェーカー上の培養物をインキュベートします。</li>
	<li>4日目に、EBを収穫し、細胞を採取し、200xgで3分間遠心分離し、上清を取り除く。 注: その後の実験の要件に従って、1x PBS で EJB を洗浄することもできます。</li>
	<li>処置を継続し、EB分化を神経前駆細胞(NPC)に誘導し、5μMレチノイン酸(RA)で分化培地を調製する。</li>
	<li>100 x g で 3 分間のエブをペレットにして古い培地を取り除くか、古い培地を吸い出す前に EB が沈着するようにします。培養プレートに5μM RAを含む分化培地10mLを加えます。</li>
	<li>6日目に、プレートを傾けて上記のように培地をピペットアウトして、培地の少なくとも半分を5μM RAを含む新鮮な培地に置き換えます。 注:5日目と7日目には、少なくとも半分の媒体を新鮮なRA含有培地に置き換えるのが推奨されます。フェノール赤いインジケータのメモを取る;黄色がかった場合は、すべての媒体を置き換えるのが最善です。</li>
	<li>8日目に、細胞を採取し、200xgで3分間遠心し、上清を取り除いてNPCを収穫する。 注:NPCは、その後の実験のニーズに応じて1倍のPBSで洗浄することもできます。必要に応じて、NPCを凍結して再び解凍して、後で培養および分析することができます。NPCを培養する場合、アキュタスはトリプシンの代替として使用することもできます。</li>
	<li>手順を継続し、NPCをニューロンに分化するには、遠心分離によって15 mLの円錐管にNPCを収集し、トリプシンで解体し、37°Cで3分間インキュベートします。ピペットNPCは、すべてのNPC凝集体が解別され、トリプシンを培地で中和することを確実にする。</li>
	<li>40 μmナイロン細胞ストレーナーで細胞をフィルターし、N2培地(DMEM/F12培地+ 3 mg/mLグルコース + 3 mg/mL 脂質豊富なウシ)の密度1.5 x 105/cm2 でめっきする前に細胞を数える 血清アルブミン(LBSA)+1:100 N2サプリメント+ 10 ng/mL bFGF + 50 U/mLペン/ストレップ + 1 mM L-グルタミン) その後のPCRおよびウェスタンブロット実験のための組織培養処理プレート;または免疫蛍光実験のための組織培養室で。</li>
	<li>9日目に、古い媒体を新鮮なN2培地に交換します。</li>
	<li>10日目にN2培地をN2/B27培地(50%DMEM/F12および50%ニューラル基底、3mg/mL LBA、1:200 N2サプリメント、1:100 B27サプリメント、50 U/mLペン/ストレップ、1mM L-グルタミン)に切り替えます。</li>
	<li>11日から12日に、次のようにニューロンを収穫します。細胞を1x PBSで洗浄し、トリプシンを加え、37°Cインキュベーターで3分間培養してから、トリプシンを培地で中和し、遠心分離機を200xgで3分間培養します。</li>
</ol>3. mESCと分化セルの特性
<ol><li>アルカリホスファターゼ(AP)アッセイ 
	<ol>
<li>キットを使用してアルカリホスファターゼの活動を評価します( 材料表を参照)。</li>
		<li>培養プレートから培地を取り出し、1x PBSでESCを洗います。</li>
		<li>キットに付属の1mLの固定溶液(ホルムアルデヒドとメタノール)をプレートに加え、室温で2〜5分間インキュベートします。 注: 修正ソリューションの過剰インキュベーションは AP アクティビティを危険にさらす可能性があります。</li>
		<li>修正液を取り出し、1x PBSでESCを洗い、プレートにいくらかの量のPBSを残します。 注: AP アクティビティを損なわないよう、PBS で ESC を湿らせておいてください。</li>
		<li>A、B、Cの基板溶液を1:1:1比で混合してAPソリューションを準備します。最初にAとB溶液を混合し、C溶液を添加する前に2分間室温で混合物をインキュベートします。</li>
		<li>1x PBS を取り外し、先ほど用意した AP ソリューションを追加します。</li>
		<li>培養プレートをアルミ箔で包むか、暗い部屋でステップ3.5を行って、暗闇の中で約15分間ESCをインキュベートします。</li>
		<li>反応を監視し、溶液が明るくなったときに反応液を除去し、非特異的な染色を避けます。</li>
		<li>1x PBSでESCを2回洗います。</li>
		<li>ESCを1x PBSまたは取り付け媒体で覆うことで、サンプルの乾燥を防ぎます。 注: AP 表現には赤または紫の染色が表示されます。プレートは4°Cの冷蔵庫に収納できます。</li>
	</ol></li>
	<li>RT-qPCR 
	<ol>
<li>ESC と EB および NPC の手順 1.6 ~ 1.7 と 2.4 に従って、さまざまな段階でセルを収集します。</li>
		<li>RNA、DNA、およびタンパク質抽出溶液を使用してRNAを分離します( 材料表を参照)。</li>
		<li>逆転写キットを使用して cDNA を生成し( 資料表を参照)、製造元のマニュアルに従います。</li>
	</ol></li>
	<li>固定と埋め込み 
	<ol>
<li>上記のようにEBとNPCを収穫し(ステップ2.6)、室温で30分間1xPBSで4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液で固定します。</li>
		<li>PFAを取り出し、サンプルを1x PBSで5分間洗います。</li>
		<li>サンプルを1x PBS、10%、20%、および30%スクロース溶液を25\u201228 °Cで連続希釈し、30分のインキュベーション後にサンプルを次の溶液に移します。 注:サンプルは、埋め込みステップを続行する前に、4 °Cで30%スクロース溶液に保存することができます。</li>
		<li>サンプルを(積み重ねずに)凍結鋳型の中心に置く前に、スクロース溶液でピペットチップを濡らし、余分な液体をピペットアウトします。 メモ: フィルター ペーパーを使用して、余分なソリューションを削除することもできます。チップチップをスクロース溶液で濡らすと、先端の壁にEBやNPCが付着するのを防ぐことができます。</li>
		<li>サンプルを再中断することなく、最適な切削温度(OCT)溶液を慎重に金型に追加し、ピペットで余分な気泡を除去します。</li>
		<li>サンプルを用いてラボのミキサーに低速で金型を置き、サンプルを軽く攪拌して15分間温かく攪拌します。これは、OCT ソリューションで再中断された場合に、EB と NPC を最下位に解決するのに役立ちます。</li>
		<li>液体窒素またはドライアイスに金型を入れることで、サンプルを素早く凍結します。 メモ:サンプルは、次のステップに進む前に-70°Cの冷凍庫に保管することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>凍結切断 
	<ol>
<li>クライオスタットを -20 ~ -18 °C に冷却してから、サンプルを器具に移します。</li>
		<li>凍結したOCTブロックを金型から取り外し、ホルダーの表面に少しOCT溶液を置いてホルダーに固定します。</li>
		<li>切り離し中にサンプルが失われないように、EB と NPC がブレードに最も近いように OCT ブロックを位置合わせします。</li>
		<li>慎重にブロックの10 μmをセクションし、サンプルを含むスライスに細心の注意を払います。</li>
		<li>サンプルを含むOCTスライスを組織埋め込みガラススライドに素早く置き、OCTスライスを室温で1時間空気乾燥させます。 メモ:サンプルは、後で使用するために-70°Cで保存することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>免疫蛍光(IF) 
	<ol>
<li>OCTセクションまたは培養チャンバーは、ニューロンを10%正常ロバ血清/0.1%トリトンX-100で1x PBSで1時間室温で1時間ブロックします。</li>
		<li>サンプルを5%正常ロバ血清/0.05%トリトンX-100で希釈した一次抗体で、4°Cで一晩1x PBSでインキュベートする。</li>
		<li>1回の洗浄でサンプルを1x PBS/0.1%トリトンX-100で洗浄します。</li>
		<li>サンプルを5%正常ロバ血清/0.05%トリトンX-100で1時間室温で1時間希釈した二次抗体でインキュベートします。</li>
		<li>1x PBS/0.1% トリトンX-100でサンプルを洗浄し、各洗浄を5分間洗浄し、1 μg/mL DAPIでサンプルをインキュベートします。</li>
		<li>カバースリップといくつかの取り付け媒体でサンプルを取り付け、乾燥させます。</li>
		<li>蛍光顕微鏡でサンプルを観察します。</li>
	</ol></li>
	<li>RNA-セクの分析 
	<ol>
<li>様々な段階で細胞を収集し、RNA抽出を行う(ステップ3.2参照)。</li>
		<li>cDNAライブラリを準備し、Wangら8に記載されているプロトコルに従って深いシーケンシングとデータ分析を行う。</li>
		<li>R パッケージ、クラスタープロファイルを使用して遺伝子オントロジー (GO) 分析を実行します。</li>
	</ol></li>
	<li>フローサイトメトリー 
	<ol>
<li>手順 1.6 ~ 1.7 に従って ESC を収集し、セルを培地で再中断します。手順 2.4 に従って、EB と NPC を収集し、セルをメディアで再中断します。</li>
		<li>40 μm ナイロンセルストレーナーを使用して、新しい 15 mL 円錐チューブにセルサスペンションをフィルターします。</li>
		<li>フローサイトメーター(施設のコア施設によって実行される)を使用してサンプルのGFP信号を測定します。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+imaging+(HCI)+on+miniaturized+three-dimensional+(3D)+cell+cultures.">High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures.</a> Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).</li></ol>

著者は、競合する財政的利益はないと宣言しています。

マウス胚性幹細胞の神経分化の方法は何十年も確立されており、研究者は以前のプロトコルを変更したり、様々な目的のために新しいプロトコルを作成し続けています7,10,11.一連のアッセイを用いて、マウスやヒトESCの他の系統分化の解析に用いることができるニューロンへのmESCの分化段階の効率と進捗状況を総合的に分...

開発中マウス胚盤胞1,2の内細胞塊からの初の導出以来、マウス胚性幹細胞(mESC)は幹細胞自己再生と分化を研究する強力なツールとして用いられてきた3。さらに、mESC分化を研究することは、神経変性疾患などの疾患の治療における幹細胞ベース療法における効率と安全性を向上させる可能性のある分子機構の多大な理解につながる4。動物モデルと比較して、このin vitroシステムは、実際と評価におけるシンプルさ、動物とは対照的に細胞株を維持する際の低コスト、および遺伝子操作における相対的な容易さなど、多くの利点を提供する。しかし、分化された細胞タイプの効率と品質は、多くの場合、mESCの異なるラインと分化方法5、6の影響を受けます。また、分化効率を評価する従来のアッセイは、堅牢性に欠ける選択されたマーカー遺伝子の定性的検査に依存しているため、遺伝子発現の世界的な変化を把握することができません。
ここでは、神経分化の系統的評価にアッセイの電池を使用することを目指しています。選択したマーカーとRNA-seqに対する従来のインビトロ分析を用いて、分化効率とこのプロセス中の転写変化を測定するためのプラットフォームを確立します。既に確立されたプロトコル7に基づいて、吊り下げ低下技術を通じて胚体(EB)を生成し、続いて上端菌量のレチノイン酸(RA)を用いて神経前駆細胞(NPC)を生成し、その後神経誘導培地でニューロンに分化した。分化の効率を調べるために、従来のRT-qPCRおよび免疫蛍光(IF)アッセイに加えて、RNA-seqおよびフローサイトメトリーを実施した。これらの分析は、ステージ固有の分化の進行を包括的に測定します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:805px;" width="804">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">25-052-CV</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">0.1% Gelatin</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">G1890-100G</td>
			<td>Prepared in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:127px;">28908</td>
			<td>Diluted in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">40-&#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:148px;">Falcon</td>
			<td style="width:127px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Albumax</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">11020021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:127px;">A11001</td>
			<td>Antibody was diluted at 1:500 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Alkaline Phosphatase Staining Kit II</td>
			<td style="width:148px;">Stemgent</td>
			<td style="width:127px;">00-0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox</td>
			<td style="width:148px;">Azura Genomics</td>
			<td style="width:127px;">AZ-2105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">BD FACSCanto</td>
			<td style="width:148px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">657338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">bFGF</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">11123149001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:148px;">Agilent</td>
			<td style="width:127px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Chir99021</td>
			<td style="width:148px;">Cayman Chemicals</td>
			<td style="width:127px;">13122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Chloroform</td>
			<td style="width:148px;">C298-500</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Chemical</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">DAPI</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:127px;">R37606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">DMEM</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">10-017-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">EB buffer</td>
			<td style="width:148px;">Qiagen</td>
			<td style="width:127px;">19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Ethanol</td>
			<td style="width:148px;">111000200</td>
			<td style="width:127px;">Pharmco</td>
			<td>Diluted in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:148px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:127px;">S10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td style="width:148px;">Illumina</td>
			<td style="width:127px;">SY-401-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:148px;">BDH1133-4LG</td>
			<td style="width:127px;">BDH VWR Analytical</td>
			<td>Diluted in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">LIF</td>
			<td style="width:148px;">N/A</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td>Collected from MEF supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">m18srRNA primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-GCAATTATTCCCCATGAACG-3&#39; 
			5&#39;-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">MEM Non-essential amino acids</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">25-025-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mNanog primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3&#39; 
			5&#39;-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">mNes primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3&#39; 
			5&#39;-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">mNeuroD1 primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3&#39; 
			5&#39;-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mOct4 primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3&#39; 
			5&#39;-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mPax6 primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3&#39; 
			5&#39;-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">N2 supplement</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Nestin primary antibody</td>
			<td style="width:148px;">Millipore</td>
			<td style="width:127px;">MAB5326</td>
			<td>Antibody was diluted at 1:200 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Neural basal</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Neurofilament primary antibody</td>
			<td style="width:148px;">DSHB</td>
			<td style="width:127px;">2H3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit</td>
			<td style="width:148px;">BioO Scientific</td>
			<td style="width:127px;">NOVA-5138-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">PD0325901</td>
			<td style="width:148px;">Cayman Chemicals</td>
			<td style="width:127px;">13034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:148px;">N/A</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td>Prepared in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">- Potassium chloride</td>
			<td style="width:148px;">P217-500G</td>
			<td style="width:127px;">VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">- Potassium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td style="width:148px;">0781-500G</td>
			<td style="width:127px;">VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">- Sodium chloride</td>
			<td style="width:148px;">BP358-10</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">- Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate</td>
			<td style="width:148px;">SX0715-1</td>
			<td style="width:127px;">Milipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Random hexamer primer</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:127px;">SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Retinoic acid</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">R2625</td>
			<td>Prepared in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">25-000-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Sucrose</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">84097</td>
			<td>Diluted in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:127px;">18064022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:148px;">Sakura</td>
			<td style="width:127px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">TriPure Isolation Reagent</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">11667165001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">TruSeq Rapid</td>
			<td style="width:148px;">Illumina</td>
			<td style="width:127px;">20020616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:148px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:127px;">BP176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation and characterization of neural progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells

マウス胚性幹細胞を神経系統に分化し、次に分化した細胞を特徴付ける一連のアッセイを行うステップバイステップの手順について述べています。E14マウス胚性幹細胞を使用して吊り下げドロップ法を介して胚体を形成し、次にレチノイン酸によって神経前駆細胞に分化し、最終的にニューロンに分化した。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)および免疫蛍光実験により、神経前駆物質およびニューロンが、8日目と12日目の分化後に対応するマーカー(神経前駆物質用のネチンとニューロンの神経フィラメント)をそれぞれ示すことが明らかになった。 Sox1 プロモーター主導のGFPレポーターを発現するE14ラインでのフローサイトメトリー実験は、8日目の細胞の約60%がGFP陽性であることを示し、この段階で神経前駆細胞の分化が成功したことを示した。最後に、RNA-seq分析を使用して、世界的な転写変化をプロファイリングしました。これらの方法は、神経細胞の分化中の細胞の同一性遷移を調節する際の特定の遺伝子および経路の関与を分析するのに有用である。

この方法の表現として、E14細胞に対してEB、NPC、およびニューロン分化実験を行いました。E14細胞は、γ照射されたMEF集団が希釈されるまでγ照射MEF(図1A)で培養した。E14細胞の多能性を確認した結果、ナノグおよびOct4マーカーに対してアルカリホスファターゼ(AP)染色(図1B)および後述のRT-qPCR(下記参照)を行うことで、E14細胞の多能性を確認し...

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Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

吊り下げドロップ法を用いて、マウス胚性幹細胞を神経細胞に分化する手順について説明する。また、RT-qPCR、免疫蛍光、RNA-seq、フローサイトメトリーを通して包括的なフェノミック解析を行っています。

マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

differentiation-characterization-neural-progenitors-neurons-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.7K ビュー.  Penn State Hershey Cancer Institute. 吊り下げドロップ法を用いて、マウス胚性幹細胞を神経細胞に分化する手順について説明する。また、RT-qPCR、免疫蛍光、RNA-seq、フローサイトメトリーを通して包括的なフェノミック解析を行っています。

ビデオ: Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

発生生物学

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

胚性幹細胞や組織の心臓分化のエピジェネティック制御

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of pancreatic progenitor cells that can be used for the study of and future treatment of diabetes. This article outlines a four-stage differentiation protocol designed to generate pancreatic progenitor cells from human embryonic stem cells (hESCs). This protocol can be applied to a number of human pluripotent stem cell (hPSC) lines. The approach taken to generate pancreatic progenitor cells is to differentiate hESCs to accurately model key stages of pancreatic development. This begins with the induction of the definitive endoderm, which is achieved by culturing the cells in the presence of Activin A, basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) and CHIR990210. Further differentiation and patterning with Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) and Dorsomorphin generates cells resembling the posterior foregut. The addition of Retinoic Acid, NOGGIN, SANT-1 and FGF10 differentiates posterior foregut cells into cells characteristic of pancreatic endoderm. Finally, the combination of Epidermal Growth Factor (EGF), Nicotinamide and NOGGIN leads to the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ cells. Flow cytometry is performed to confirm the expression of specific markers at key stages of pancreatic development. The PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors at the end of stage 4 are capable of generating mature &#946; cells upon transplantation into immunodeficient mice and can be further differentiated to generate insulin-producing cells in vitro. Thus, the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors, as demonstrated in this protocol, is of great importance as it provides a platform to study human pancreatic development in vitro and provides a source of cells with the potential of differentiating to &#946; cells that could eventually be used for the treatment of diabetes.

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Here we describe a 4-stage protocol to differentiate human embryonic stem cells to NKX6-1+ pancreatic progenitors in vitro. This protocol can be applied to a variety of human pluripotent stem cell lines.

NKX6-1への多能性幹細胞の効率的分化<sup&gt; +</sup&gt;膵臓前駆細胞

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

分離、カルチャ、および骨髄間質細胞とマウスから破骨細胞前駆細胞の分化

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.

末梢単核細胞からの誘導神経幹細胞の生成と移植研究におけるドーパミン作動性ニューロン前駆体への分化

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

初期マウス胚からのシーケンシングのための小型RNAライブラリーの調製

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...