Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del NIH (1R35GM133496-01) a Z. Gao. Vorremmo ringraziare il Dr. Ryan Hobbs per l'assistenza nel sezionamento. Ringraziamo le strutture principali del Penn State College of Medicine, tra cui le scienze del genoma e la bioinformatica, l'Advanced Light Microscopy Imaging e la citometria a flusso. Ringraziamo anche il Dr. Yuka Imamura per l'assistenza nell'analisi RNA-seq.

1. Cultura mESC
<ol><li>Rivestire una piastra di 10 cm trattata con coltura tissutale con lo 0,1% di gelatina e lasciare riposare la gelatina per almeno 15-30 minuti prima di aspirarla.</li>
	<li>I fibroblasti embrionali di topo (MEF) irradiati γ un giorno prima di coltivare le mESC nel mezzo mESC preriscaldato (Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) with 15% fetale bovine serum (FBS), aminoacidi non essenziali, β-mercaptoetanolo, L-glutammina, penicillina/streptomicina, piruvato di sodio, LIF, PD0325901 (PD) e Chir99021 (CH)).</li>
	<li>Consentire ai MEF irradiati γ di depositarsi e attaccarsi alla superficie della piastra prima di coltivare le cellule E14.</li>
	<li>Scongelare gli ESC E14 a bagnomaria a 37 °C e trasferire rapidamente le celle in un tubo conico di 15 cm con mezzo caldo mESC. Pellet le celle a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Risospese le cellule in 10 mL di terreno mESC e placcare le cellule sulla piastra di coltura contenente i MEF irradiati γ seminati in precedenza. Incubare la coltura cellulare in un incubatore a 37 °C sotto il 5% di CO2.</li>
	<li>Per il passaggio in coltura, aspirare il mezzo e lavare la piastra con 1x PBS sterile. Aggiungere abbastanza 0,05% di tripsina per coprire la superficie della piastra e incubare a 37 °C per 3 minuti.</li>
	<li>Neutralizzare la tripsina con mezzo mESC e pipetta per generare sospensione monocellulare. Centrifugare le cellule a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Contare le cellule con un emocitometro o un contatore cellulare e seminare circa 5,0 x 105 cellule in una piastra di coltura di 10 cm.</li>
	<li>Risospese le cellule in 10 mL di mezzo mESC, placcare le cellule sulla piastra di coltura tissutale rivestita di gelatina e incubare le colture come descritto in precedenza. NOTA: Si raccomanda di passare le mESC ogni 2 giorni per evitare che le cellule si differenzino nelle loro colonie. Il rosso fenolo nel mezzo funziona esclusivamente come indicatore di pH e, a seconda della densità cellulare, può diventare giallastro (più acido), prima di 2 giorni. Quindi, potrebbe essere necessario cambiare il mezzo ogni giorno. I MEF irradiati γ alla fine moriranno dopo un paio di passaggi.</li>
</ol>2. Differenziazione di EB, NPC e neuroni
<ol><li>Eseguire il protocollo di passaggio di coltura menzionato in precedenza e contare le cellule (passaggi 1.7-1.10).</li>
	<li>Metodo di goccia sospesa (giorno 0)<ol>
<li>Per una piastra di coltura cellulare di 10 cm, contare circa 2,5 x 104 cellule in cui 5,0 x 102 cellule saranno sospese in un mezzo di differenziazione da 20 μL (DMEM con 15% FBS, aminoacidi non essenziali, β-mercaptoetanolo, L-glutammina, penicillina / streptomicina e piruvato di sodio). Circa cinquanta goccioline da 20 μL contenenti le cellule possono essere placcate su una piastra da 10 cm.</li>
		<li>Aliquotare il numero appropriato di cellule, quindi centrifugare le cellule a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Risospese le cellule nel volume appropriato del mezzo di differenziazione per una densità cellulare di 5,0 x 102 cellule per 20 μL (ad esempio, 2,5 x 104 cellule in 1 mL di mezzo di differenziazione).</li>
		<li>Utilizzando una micropipetta o una pipetta ripetitore, posizionare 20 μL di goccioline della sospensione cellulare sul coperchio della piastra di coltura tissutale. Assicurati che le goccioline non siano troppo vicine l'una all'altra per impedire loro di fondersi. NOTA: le goccioline possono essere placcate su una piastra di fissaggio trattata con coltura di tessuto o su una piastra di sospensione in quanto verranno posizionate sul coperchio e non sulla piastra stessa. Per un approccio più fattibile e sterile, piallare le goccioline su una piastra di coltura tissutale di attacco e trasferirle su una piastra di sospensione come descritto di seguito.</li>
		<li>Riempire la piastra con 5-10 ml di 1x PBS e rimettere con cura il coperchio sulla piastra. Incubare la coltura nell'incubatore a 37 °C. NOTA: PBS viene aggiunto alla piastra di coltura per evitare che le goccioline si secchino.</li>
	</ol></li>
	<li>Il giorno 2,utilizzare una micropipetta per raccogliere le goccioline dal coperchio e metterle in una piastra di sospensione per colture cellulari di 10 cm riempita con 10 ml di mezzo di differenziazione. Incubare la coltura su uno shaker orbitale che scuote a bassa velocità nell'incubatore.</li>
	<li>Il giorno 4,per raccogliere gli EB, raccogliere le cellule, centrifugare a 200 x g per 3 min e rimuovere il surnatante. NOTA: Gli EB possono anche essere lavati con 1x PBS secondo i requisiti degli esperimenti successivi.</li>
	<li>Per continuare la procedura e indurre la differenziazione EB in cellule progenitrici neurali (NPC), preparare il mezzo di differenziazione con acido retinoico (RA) da 5 μM.</li>
	<li>Rimuovere il vecchio mezzo pellettizzando gli EB a 100 x g per 3 minuti o lasciare che gli EB si depositino prima di aspirare il vecchio mezzo. Aggiungere 10 ml del mezzo di differenziazione contenente 5 μM RA alla piastra di coltura.</li>
	<li>Il giorno 6, sostituire almeno la metà del mezzo con un mezzo fresco contenente 5 μM RA inclinando la piastra e pipettando il mezzo come descritto sopra. NOTA: Si raccomanda di sostituire almeno la metà del mezzo con un mezzo fresco contenente RA nei giorni 5 e 7. Prendi nota dell'indicatore rosso fenolo; se diventa giallastro, è meglio sostituire tutto il mezzo.</li>
	<li>Il giorno 8,raccogli gli NPC raccogliendo le cellule, centrifugando a 200 x g per 3 minuti e rimuovendo il surnatante. NOTA: Gli NPC possono anche essere lavati con 1x PBS in base alle esigenze degli esperimenti successivi. Se necessario, gli NPC possono essere congelati e scongelati di nuovo per una successiva coltura e analisi. Se gli NPC devono essere coltivati, l'accutasi può anche essere usato come alternativa alla tripsina.</li>
	<li>Per continuare la procedura e differenziare gli NPC in neuroni, raccogliere gli NPC in un tubo conico da 15 ml mediante centrifugazione, dissociarli con tripsina e incubarli a 37 °C per 3 min. Pipettare gli NPC per garantire che tutti gli aggregati NPC siano dissociati e neutralizzare la tripsina con il mezzo.</li>
	<li>Filtrare le cellule con un colino di cellule di nylon da 40 μm e contare le cellule prima di placcarle ad una densità di 1,5 x10 5/cm2 in mezzo N2 (DMEM/F12 medio + 3 mg/mL di glucosio + 3 mg/mL di albumina sierica bovina ricca di lipidi (LBSA) + supplemento di 1:100 N2 + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL penna/streptococco + 1 mM di L-glutammina) su una piastra trattata con colture tissutali per successivi esperimenti di PCR e western blot; o su una camera di coltura tissutale per esperimenti di immunofluorescenza.</li>
	<li>Il giorno 9, sostituire il vecchio mezzo con un mezzo N2 fresco.</li>
	<li>Il giorno 10,cambiare il mezzo N2 con il mezzo N2 / B27 (50% DMEM / F12 e 50% basale neurale, 3 mg / mL LBA, 1: 200 N2 supplemento, 1: 100 B27 supplemento, 50 U / mL penna / streptococco e 1 mM L-glutammina).</li>
	<li>Nei giorni 11-12, raccogliere i neuroni come segue. Lavare le cellule con 1x PBS, aggiungere tripsina e incubare la coltura nell'incubatore a 37 °C per 3 minuti prima di neutralizzare la tripsina con mezzo e centrifugare a 200 x g per 3 min.</li>
</ol>3. Caratterizzazione di mESC e cellule differenziate
<ol><li>Saggio della fosfatasi alcalina (AP) 
	<ol>
<li>Utilizzare un kit per valutare l'attività della fosfatasi alcalina (vedere la Tabella dei materiali).</li>
		<li>Rimuovere il mezzo dalla piastra di coltura e lavare gli ESC con 1x PBS.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL della soluzione fissa (composta da formaldeide e metanolo) fornita con il kit alla piastra e incubarla a temperatura ambiente per 2-5 minuti. NOTA: l'eccessiva incubazione nella soluzione di correzione può compromettere l'attività pa.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione fissa, lavare gli ESC con 1x PBS e lasciare una certa quantità di PBS nella piastra. NOTA: mantenere le ESC umide in PBS per non compromettere l'attività AP.</li>
		<li>Preparare la soluzione AP mescolando le soluzioni di substrato A, B e C con un rapporto 1:1:1. Mescolare prima le soluzioni A e B e incubare la miscela a temperatura ambiente per 2 minuti prima di aggiungere la soluzione C.</li>
		<li>Rimuovere il PBS 1x e aggiungere la soluzione AP preparata in precedenza.</li>
		<li>Incubare gli ESC per circa 15 minuti al buio avvolgendo la piastra di coltura con un foglio di alluminio o eseguendo il passaggio 3.5 in una stanza buia.</li>
		<li>Monitorare la reazione e rimuovere la soluzione di reazione quando la soluzione diventa luminosa per evitare macchie non specifiche.</li>
		<li>Lavare gli ESC due volte con 1x PBS.</li>
		<li>Evitare che il campione si asciughi coprendo gli ESC con 1x PBS o mezzo di montaggio. NOTA: per l'espressione AP verrà visualizzata una macchia rossa o viola. La piastra può essere conservata in frigorifero a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>RT-qPCR 
	<ol>
<li>Raccogliere le cellule in varie fasi seguendo i passaggi 1.6-1.7 e 2.4 rispettivamente per ESC ed EB e NPC.</li>
		<li>Isolare l'RNA utilizzando RNA, DNA e soluzione di estrazione proteica (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Genera cDNA con un kit di trascrittasi inversa (vedi la Tabella dei materiali)e segui il manuale del produttore.</li>
	</ol></li>
	<li>Fissazione e incorporamento 
	<ol>
<li>Raccogliere EB e NPC come descritto sopra (fase 2.6) e fissarli con una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% in 1x PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il PFA e lavare il campione con 1x PBS per 5 minuti.</li>
		<li>Posizionare il campione in una diluizione seriale di 1s PBS, 10%, 20% e 30% di saccarosio a 25\u201228 °C, dove il campione viene trasferito alla soluzione successiva dopo 30 minuti di incubazione. NOTA: Il campione può essere conservato nella soluzione di saccarosio al 30% a 4 °C prima di continuare con la fase di incorporamento.</li>
		<li>Bagnare la punta della pipetta con soluzione di saccarosio prima di posizionare il campione (senza impilarli) al centro del criostampo e pipettare il liquido in eccesso. NOTA: la carta da filtro può essere utilizzata anche per rimuovere la soluzione in eccesso. Bagnare la punta della pipetta con una soluzione di saccarosio è importante per evitare che gli EB e gli NPC si attacchino alle pareti della punta.</li>
		<li>Aggiungere con attenzione la soluzione a temperatura di taglio ottimale (OCT) allo stampo senza sospescere nuovamente i campioni e rimuovere le bolle in eccesso con una pipetta.</li>
		<li>Posizionare lo stampo con il campione su un miscelatore da laboratorio a bassa velocità per agitare leggermente il campione per 15 minuti. Questo aiuta a sistemare gli EB e gli NPC verso il basso se vengono risospesi nella soluzione OCT.</li>
		<li>Congelare rapidamente il campione posizionando lo stampo in azoto liquido o su ghiaccio secco. NOTA: i campioni possono essere conservati in un congelatore a -70 °C prima di passare al passaggio successivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Criosezione 
	<ol>
<li>Impostare il criostato in modo che si raffreddi a -20--18 °C prima di trasferire il campione allo strumento.</li>
		<li>Staccare il blocco OCT congelato dallo stampo e fissarlo sul supporto con una piccola soluzione OCT posizionata sulla superficie del supporto.</li>
		<li>Allineare il blocco dello Strumento di personalizzazione di Office in modo che gli NB e gli NPC siano più vicini al pannello per garantire che il campione non vada perso durante il sezionamento.</li>
		<li>Sezionare con attenzione 10 μm del blocco e prestare molta attenzione alle fette che contengono il campione.</li>
		<li>Posizionare rapidamente la fetta OCT contenente il campione sul vetrino di vetro che incorpora il tessuto e lasciare asciugare all'aria le fette OCT per 1 ora a temperatura ambiente. NOTA: I campioni possono essere conservati a -70 °C per un uso successivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunofluorescenza (IF) 
	<ol>
<li>Blocca sezioni OCT o camere di coltura contenenti neuroni in 10% di siero d'asino normale / 0,1% Triton X-100 in 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare i campioni in anticorpi primari diluiti in siero d'asino normale al 5% e Triton X-100 allo 0,05% in 1x PBS durante la notte a 4 °C.</li>
		<li>Lavare i campioni in 1x PBS/0,1% Triton X-100 tre volte per 5 minuti ogni lavaggio.</li>
		<li>Incubare i campioni con anticorpi secondari diluiti in siero d'asino normale al 5% / Triton X-100 allo 0,05% in 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavare i campioni in 1x PBS/0,1% Triton X-100 tre volte per 5 minuti ogni lavaggio, quindi incubare i campioni in 1 μg/mL DAPI.</li>
		<li>Montare i campioni con un coperchio e un mezzo di montaggio e lasciarlo asciugare.</li>
		<li>Osservare i campioni al microscopio a fluorescenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi RNA-seq 
	<ol>
<li>Raccogliere le cellule in varie fasi ed eseguire l'estrazione dell'RNA (vedere il passaggio 3.2).</li>
		<li>Preparare le librerie di cDNA, eseguire il sequenziamento profondo e l'analisi dei dati secondo il protocollo descritto in Wang et al.8.</li>
		<li>Eseguire l'analisi gene ontology (GO) utilizzando il pacchetto R, clusterProfiler.</li>
	</ol></li>
	<li>Citometria a flusso 
	<ol>
<li>Raccogliere le ESC seguendo i passaggi 1.6-1.7 e risospensionare le celle nel mezzo. Raccogliere gli EB e gli NPC seguendo il passaggio 2.4 e risospensionare le cellule nel mezzo.</li>
		<li>Filtrare la sospensione cellulare utilizzando il filtro per celle di nylon da 40 μm in un nuovo tubo conico da 15 ml.</li>
		<li>Misurare il segnale GFP dei campioni utilizzando il citometro a flusso (eseguito dalla struttura principale dell'istituzione).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-layer:+The+case+for+3D+bioprinting+neurons+to+create+patient-specific+epilepsy+models.">Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models.</a> Materials. 12 (19), (2019).</li><li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture.">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li><li>Joshi, P., Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+imaging+(HCI)+on+miniaturized+three-dimensional+(3D)+cell+cultures.">High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures.</a> Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).</li></ol>

Gli autori dichiarano che non ci sono interessi finanziari concorrenti.

Il metodo per la differenziazione neurale delle cellule staminali embrionali di topo è stato stabilito per decenni e i ricercatori hanno continuato a modificare i protocolli precedenti o crearne di nuovi per vari scopi7,10,11. Abbiamo utilizzato una serie di saggi per analizzare in modo completo l'efficienza e il progresso delle fasi di differenziazione delle mESC ai neuroni, che possono essere utilizzate nell'analisi di altre ...

Fin dalla loro prima derivazione dalla massa cellulare interna delle blastocisti di topo in via di sviluppo1,2,le cellule staminali embrionali di topo (mESC) sono state utilizzate come potenti strumenti per studiare l'auto-rinnovamento e la differenziazione delle cellule staminali3. Inoltre, lo studio della differenziazione mESC porta a un'enorme comprensione dei meccanismi molecolari che possono migliorare l'efficienza e la sicurezza nella terapia basata sulle cellule staminali nel trattamento di malattie come i disturbi neurodegenerativi4. Rispetto ai modelli animali, questo sistema in vitro offre molti vantaggi, tra cui semplicità nella pratica e nella valutazione, basso costo nel mantenimento delle linee cellulari in contrasto con gli animali e relativa facilità nelle manipolazioni genetiche. Tuttavia, l'efficienza e la qualità dei tipi di cellule differenziate sono spesso influenzate da diverse linee di mESC e dai metodi di differenziazione5,6. Inoltre, i saggi tradizionali per valutare l'efficienza della differenziazione si basano sull'esame qualitativo di geni marcatori selezionati che mancano di robustezza e quindi non riescono a cogliere i cambiamenti globali nell'espressione genica.
Qui miriamo a utilizzare una batteria di saggi per la valutazione sistematica della differenziazione neuronale. Utilizzando sia le tradizionali analisi in vitro su marcatori selezionati che l'RNA-seq, stabiliamo una piattaforma per la misurazione dell'efficienza di differenziazione e dei cambiamenti trascrittomici durante questo processo. Sulla base di un protocollo precedentemente stabilito7,abbiamo generato corpi embrioidi (EB) attraverso la tecnica della goccia sospesa, seguita dall'induzione utilizzando la quantità soprafisiologica di acido retinoico (RA) per generare cellule progenitrici neurali (NPC), che sono state successivamente differenziate in neuroni con mezzo di induzione neurale. Per esaminare l'efficienza del differenziamento, oltre ai tradizionali test RT-qPCR e immunofluorescenza (IF), abbiamo eseguito RNA-seq e citometria a flusso. Queste analisi forniscono una misurazione completa della progressione della differenziazione specifica dello stadio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:805px;" width="804">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">25-052-CV</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">0.1% Gelatin</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">G1890-100G</td>
			<td>Prepared in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:127px;">28908</td>
			<td>Diluted in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">40-&#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:148px;">Falcon</td>
			<td style="width:127px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Albumax</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">11020021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:127px;">A11001</td>
			<td>Antibody was diluted at 1:500 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Alkaline Phosphatase Staining Kit II</td>
			<td style="width:148px;">Stemgent</td>
			<td style="width:127px;">00-0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox</td>
			<td style="width:148px;">Azura Genomics</td>
			<td style="width:127px;">AZ-2105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">BD FACSCanto</td>
			<td style="width:148px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">657338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">bFGF</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">11123149001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:148px;">Agilent</td>
			<td style="width:127px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Chir99021</td>
			<td style="width:148px;">Cayman Chemicals</td>
			<td style="width:127px;">13122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Chloroform</td>
			<td style="width:148px;">C298-500</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Chemical</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">DAPI</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:127px;">R37606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">DMEM</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">10-017-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">EB buffer</td>
			<td style="width:148px;">Qiagen</td>
			<td style="width:127px;">19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Ethanol</td>
			<td style="width:148px;">111000200</td>
			<td style="width:127px;">Pharmco</td>
			<td>Diluted in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:148px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:127px;">S10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td style="width:148px;">Illumina</td>
			<td style="width:127px;">SY-401-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:148px;">BDH1133-4LG</td>
			<td style="width:127px;">BDH VWR Analytical</td>
			<td>Diluted in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">LIF</td>
			<td style="width:148px;">N/A</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td>Collected from MEF supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">m18srRNA primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-GCAATTATTCCCCATGAACG-3&#39; 
			5&#39;-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">MEM Non-essential amino acids</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">25-025-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mNanog primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3&#39; 
			5&#39;-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">mNes primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3&#39; 
			5&#39;-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">mNeuroD1 primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3&#39; 
			5&#39;-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mOct4 primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3&#39; 
			5&#39;-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mPax6 primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3&#39; 
			5&#39;-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">N2 supplement</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Nestin primary antibody</td>
			<td style="width:148px;">Millipore</td>
			<td style="width:127px;">MAB5326</td>
			<td>Antibody was diluted at 1:200 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Neural basal</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Neurofilament primary antibody</td>
			<td style="width:148px;">DSHB</td>
			<td style="width:127px;">2H3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit</td>
			<td style="width:148px;">BioO Scientific</td>
			<td style="width:127px;">NOVA-5138-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">PD0325901</td>
			<td style="width:148px;">Cayman Chemicals</td>
			<td style="width:127px;">13034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:148px;">N/A</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td>Prepared in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">- Potassium chloride</td>
			<td style="width:148px;">P217-500G</td>
			<td style="width:127px;">VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">- Potassium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td style="width:148px;">0781-500G</td>
			<td style="width:127px;">VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">- Sodium chloride</td>
			<td style="width:148px;">BP358-10</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">- Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate</td>
			<td style="width:148px;">SX0715-1</td>
			<td style="width:127px;">Milipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Random hexamer primer</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:127px;">SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Retinoic acid</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">R2625</td>
			<td>Prepared in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">25-000-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Sucrose</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">84097</td>
			<td>Diluted in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:127px;">18064022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:148px;">Sakura</td>
			<td style="width:127px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">TriPure Isolation Reagent</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">11667165001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">TruSeq Rapid</td>
			<td style="width:148px;">Illumina</td>
			<td style="width:127px;">20020616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:148px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:127px;">BP176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation and characterization of neural progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells

Descriviamo la procedura passo-passo per la coltura e la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in lignaggi neuronali, seguita da una serie di saggi per caratterizzare le cellule differenziate. Le cellule staminali embrionali di topo E14 sono state utilizzate per formare corpi embrioidi attraverso il metodo della goccia sospesa, e poi indotte a differenziarsi in cellule progenitrici neurali dall'acido retinoico e infine differenziate in neuroni. La reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (RT-qPCR) e gli esperimenti di immunofluorescenza hanno rivelato che i progenitori neurali e i neuroni mostrano marcatori corrispondenti (nestina per i progenitori neurali e neurofilamento per i neuroni) rispettivamente al giorno 8 e 12 post-differenziazione. Esperimenti di citometria a flusso su una linea E14 che esprime un reporter GFP guidato dal promotore Sox1 hanno mostrato che circa il 60% delle cellule al giorno 8 sono GFP positive, indicando la differenziazione di successo delle cellule progenitrici neurali in questa fase. Infine, l'analisi RNA-seq è stata utilizzata per profilare i cambiamenti trascrittomici globali. Questi metodi sono utili per analizzare il coinvolgimento di geni e percorsi specifici nella regolazione della transizione dell'identità cellulare durante la differenziazione neuronale.

Come rappresentazione del nostro metodo, abbiamo eseguito un esperimento di differenziazione EB, NPC e neuroni su cellule E14. Le cellule E14 sono state coltivate su MEF irradiati γ (Figura 1A) fino a quando la popolazione meF irradiata γ non si è diluita. Abbiamo confermato la pluripotenza delle cellule E14 eseguendo la colorazione della fosfatasi alcalina (AP)(Figura 1B)e successivamente RT-qPCR (vedi sotto) per i marcatori Nanog e Oct4. L...

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Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Descriviamo la procedura per la differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo in cellule neuronali utilizzando il metodo della goccia sospesa. Inoltre, eseguiamo un'analisi fenotipica completa attraverso RT-qPCR, immunofluorescenza, RNA-seq e citometria a flusso.

Differenziazione e caratterizzazione di progenitori neurali e neuroni da cellule staminali embrionali di topo

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

differentiation-characterization-neural-progenitors-neurons-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.7K Views.  Penn State Hershey Cancer Institute. Descriviamo la procedura per la differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo in cellule neuronali utilizzando il metodo della goccia sospesa. Inoltre, eseguiamo un'analisi fenotipica completa attraverso RT-qPCR, immunofluorescenza, RNA-seq e citometria a flusso.

Video: Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali di topo in siero privo monostrato Cultura

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

Regolazione epigenetica del Cardiac differenziazione delle cellule staminali embrionali e Tessuti

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of pancreatic progenitor cells that can be used for the study of and future treatment of diabetes. This article outlines a four-stage differentiation protocol designed to generate pancreatic progenitor cells from human embryonic stem cells (hESCs). This protocol can be applied to a number of human pluripotent stem cell (hPSC) lines. The approach taken to generate pancreatic progenitor cells is to differentiate hESCs to accurately model key stages of pancreatic development. This begins with the induction of the definitive endoderm, which is achieved by culturing the cells in the presence of Activin A, basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) and CHIR990210. Further differentiation and patterning with Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) and Dorsomorphin generates cells resembling the posterior foregut. The addition of Retinoic Acid, NOGGIN, SANT-1 and FGF10 differentiates posterior foregut cells into cells characteristic of pancreatic endoderm. Finally, the combination of Epidermal Growth Factor (EGF), Nicotinamide and NOGGIN leads to the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ cells. Flow cytometry is performed to confirm the expression of specific markers at key stages of pancreatic development. The PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors at the end of stage 4 are capable of generating mature &#946; cells upon transplantation into immunodeficient mice and can be further differentiated to generate insulin-producing cells in vitro. Thus, the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors, as demonstrated in this protocol, is of great importance as it provides a platform to study human pancreatic development in vitro and provides a source of cells with the potential of differentiating to &#946; cells that could eventually be used for the treatment of diabetes.

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Here we describe a 4-stage protocol to differentiate human embryonic stem cells to NKX6-1+ pancreatic progenitors in vitro. This protocol can be applied to a variety of human pluripotent stem cell lines.

Differenziazione efficiente delle pluripotenti cellule staminali per NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; progenitori pancreatici

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Analisi di acido retinoico-indotta neurale differenziazione di cellule staminali embrionali di topo a organi embrionali due e tridimensionali

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Rapida, regia di differenziazione delle cellule epiteliali del pigmento retinico da cellule staminali pluripotenti umane embrionali o indotto

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

Isolamento, la cultura e la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo e dei progenitori degli osteoclasti dai topi

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.

Generazione di cellule staminali neurali indotte da cellule mononucleari periferiche e differenziazione verso i precursori dei neuroni dopaminergici per gli studi di trapianto

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

Preparazione di piccole librerie di RNA per il sequenziamento da embrioni di topo precoce

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...