هذا البروتوكول يتيح تحديد كمي للمنطقة، محيط، وشكل هيكل داخل الخلية من صورتها ثنائية الأبعاد. هذه التقنية سريعة وسهلة، وتتطلب فقط إعدادات مختبرية قياسية ومجهر confocal وتستخدم برمجيات المصدر المفتوح. إثبات الإجراء سيكون آنا Balcerak، طالبة دكتوراه من مختبري.
تبدأ بزرع أربع مرات 10 إلى الخلايا الخامسة في 0.5 ملليلتر من الثقافة المتوسطة في البئر في أربع آبار الكولاجين شريحة غرفة واحدة المغلفة لثقافة 24 ساعة في 37 درجة مئوية وحاضنة ثاني أكسيد الكربون خمس درجات. في صباح اليوم التالي، استخدم مجهرًا مقلوبًا بصريًا للتحقق من وجود طبقة أحادية 90٪ على الأقل واستخدام مجهر confocal للحصول على صور واحدة لشريحة Z. لتحليل التصاق البؤري، افتح الصور في ImageJ وحدد التحليل، وتعيين المقياس، وإزالة المقياس، والعالمي لتعيين مقياس الصورة بالبكسل.
لتضمين اسم الملف والمنطقة التي تهمك في خيارات القياس، انقر فوق تحليل وتعيين القياسات وتحقق من المساحة وخيارات التسمية. لطرح الخلفية، حدد العملية والطرح الخلفية. تعيين نصف قطر الكرة المتداول إلى 50 بكسل والتحقق من انزلاق القطع المكافئ.
لتحديد مساحة أصغر منطقة ذات أهمية، حدد الالتصاق البؤري الأحادي الأصغر وانقر فوق التحليل والمقياس لقياس المنطقة. عندما يتم اختيار ما لا يقل عن 20 منطقة ذات أهمية وقياسها، حساب وحفظ متوسط النتائج التي تم الحصول عليها. تعيين الحد العلوي إلى 25٪ من منطقة خلية نموذجية.
لمنح الصورة إلى ثنائي، انقر فوق الصورة، ضبط، وعتبة، والتحقق من الافتراضي، أبيض وأسود، والخلفية الداكنة. لقياس عدد المناطق ذات الاهتمام ومناطقها، حدد تحليل الجسيمات وتحليلها، ثم قم بفحص وحدات البكسل، وعرض النتائج، ووضوح النتائج، والتلخيص. نقل بيانات حجم الشريحة والعد والإجمالي للمنطقة من نافذة الملخص إلى برنامج إدارة البيانات الذي تختاره.
للحصول على كمية الالتصاق البؤري ، افتح الماكرو الالتصاق البؤري ImageJ وأدخل منطقة أصغر منطقة ذات أهمية كمنطقة أصغر معلمة منطقة ذات أهمية. تعيين قيمة نوع العتبة إلى يدوي أو تلقائي وحفظ التغييرات. ثم قم باستدعاء الماكرو من ImageJ وحدد الصورة التي ستتم معالجتها.
لتحليل شكل الخلية يدوياً، افتح صورة في برنامج معالجة صور مناسب وحدد المعلمات التي سيتم قياسها. استخدم أداة التحديد اليدوي لتحديد حدود الخلية يدويًا كما تم تمييزها من قبل بروتينات الوصلات المختارة. سيتم حساب المعلمات المختارة تلقائياً لكل خلية.
عند تحديد كافة الخلايا، حدد التحرير والتحديد وإضافة إلى المدير. يجب تحديد الخلايا الكاملة التي لها حدود غير متقطعة. لإجراء القياس، ضع علامة على جميع الأرقام التي تظهر في المربع الأيسر من إدارة منطقة الاهتمام وانقر على قياس.
ستظهر النتائج في مربع النتائج ويمكن استيرادها إلى جدول البيانات الذي تختاره. تحليل الخلايا الآلي يسهل تحديد كمي لعدد كبير من الخلايا. لكل نوع خلية جديدة تشغيل الماكرو أولاً لتأسيس معلمات.
عند انتهاء الماكرو، حدد تعيين حدود حجم الخلية. انقر فوق تسمية أصغر وأكبر الخلايا وانقر فوق قياس. تعيين قيمة أصغر خلية ومتغيرات الخلية أكبر وحفظ التغييرات.
أغلق كافة إطارات الماكرو وحدد الصورة التي ستتم معالجتها في تدرج الرمادي. ثم قم بتشغيل الماكرو مرة أخرى. سيوفر الماكرو جدول النتائج التي تتضمن فهرس شكل الخلية ونسبة العرض إلى الارتفاع و مناطق تحديدات مناطق الاهتمام بيانات قائمة.
هنا ، يمكن ملاحظة صور تمثيلية للالتصاقات البؤرية التي تم حسابها مع ImageJ بما في ذلك الخطوط العريضة المرقمة النهائية وتراكبات الخطوط العريضة للتصاق البؤري مع الصورة الأصلية لكل من خطوط التحكم والخلية الناجمة. كما هو موضح في هذا التحليل، أظهرت الخلايا الهالكة عددًا أكبر من الالتصاقات لكل خلية بالإضافة إلى التصاقات أكبر حجمًا مقارنة بخلايا خط الخلايا. في هذه الصور، يتم عرض المناطق التمثيلية من أحادية الخلايا المعالجة وغير المعالجة بشكل كيميائي.
وقد تميزت خلايا المخطط التفصيلي وفقا لقيم مؤشر شكل الخلايا الخاصة بها، على سبيل المثال في هذا التحليل الذي يظهر زيادة في سلة المهملات الأخيرة وتسوية القمم الرئيسية للخلايا المعالجة بالعقاقير مقارنة بالضوابط غير المعالجة. ويمكن بعد ذلك إنشاء توزيع ترددي وتوزيع تراكمي لكل استزراع خلية. سمح التصوير الرمادي للطبقات الأحادية كما هو موضح بتحليل وتكميم 512 خلية من 12 حقل عرض يكشف عن توزيع تردد نسبي لمؤشر شكل الخلية.
لهذا البروتوكول للعمل، من المهم استخدام الصور من أفضل نوعية ممكنة. وينبغي أن يضمن البذر السليم للخلايا، والتلطيخ، والتصوير صورًا ذات جودة تجريبية كافية.
