Ce protocole permet la quantification de la zone, du périmètre et de la forme de la structure intracellulaire à partir de son image bidimensionnelle. Cette technique est rapide et facile, ne nécessite que des réglages de laboratoire standard et un microscope confocal et utilise un logiciel opensource. Anna Balcerak, doctorante de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Commencez par ensemencement quatre fois 10 à la cinquième cellule dans 0,5 millilitres de milieu de culture par puits dans un collagène de quatre puits une diapositive de chambre enduite pour une culture de 24 heures dans un incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius et cinq degrés. Le lendemain matin, utilisez un microscope optique inversé pour vérifier la présence d’au moins 90 % de monocouche confluente et utilisez un microscope confocal pour obtenir des images en tranches Z. Pour l’analyse de l’adhérence focale, ouvrez les images d’ImageJ et sélectionnez analyser, définir l’échelle, supprimer l’échelle et global pour définir l’échelle d’image en pixels.
Pour inclure le nom de fichier et la zone de la région d’intérêt dans les options de mesure, cliquez sur analyser et définir les mesures et vérifiez la zone et affichez les options d’étiquette. Pour soustraire l’arrière-plan, sélectionnez le processus et soustrayez l’arrière-plan. Réglez le rayon de la boule roulante à 50 pixels et vérifiez le paraboloïde coulissant.
Pour déterminer la zone de la plus petite région d’intérêt, décrivons la plus petite adhérence focale et cliquez sur analyser et mesurer pour mesurer la zone. Lorsqu’au moins 20 régions d’intérêt ont été sélectionnées et mesurées, calculer et enregistrer la moyenne des résultats obtenus. Réglez la limite supérieure à 25 % d’une zone cellulaire typique.
Pour conférer l’image au binaire, cliquez sur l’image, ajustez et seuilz, et vérifiez par défaut, noir et blanc, et fond foncé. Pour mesurer le nombre et les zones des régions d’intérêt, sélectionnez analyser et analyser les unités de particules et de pixels, afficher les résultats, obtenir des résultats clairs et résumer. Transférez les données de taille moyenne de la tranche, du nombre et de la superficie totale de la fenêtre récapitulatif au programme de gestion des données de choix.
Pour la quantification de l’adhérence focale, ouvrez l’adhérence focale ImageJ macro et entrez dans la zone de la plus petite région d’intérêt comme zone de la plus petite région de paramètre d’intérêt. Réglez la valeur de type seuil à manuelle ou automatique et enregistrez les modifications. Ensuite, appelez la macro d’ImageJ et sélectionnez l’image à traiter.
Pour l’analyse manuelle de la forme des cellules, ouvrez une image dans un logiciel de traitement d’image approprié et sélectionnez les paramètres à mesurer. Utilisez l’outil de sélection à main levée pour délimité manuellement les bordures cellulaires marquées par les protéines de jonction de choix. Les paramètres choisis seront automatiquement calculés pour chaque cellule.
Lorsque toutes les cellules ont été décrites, sélectionnez modifier, sélectionner et ajouter au gestionnaire. Seules les cellules entièrement visibles complètes avec des bordures ininterrompues doivent être sélectionnées. Pour effectuer la mesure, marquez tous les numéros apparaissant dans la boîte gauche du gestionnaire de la région d’intérêt et cliquez sur la mesure.
Les résultats apparaîtront dans la boîte de résultats et peuvent être importés sur la feuille de calcul de choix. L’analyse cellulaire automatisée facilite la quantification du grand nombre de cellules. Pour chaque nouveau type de cellule, exécutez d’abord la macro pour établir des paramètres.
Lorsque la macro est terminée, sélectionnez définir les limites de taille des cellules. Cliquez sur l’étiquette des cellules les plus petites et les plus grandes et cliquez sur mesurer. Définissez la valeur de la plus petite cellule et des plus grandes variables cellulaires et enregistrez les modifications.
Fermez toutes les fenêtres macro et sélectionnez l’image à traiter en gris. Ensuite, exécutez la macro à nouveau. La macro fournira un tableau des résultats qui inclut l’indice de forme cellulaire, le rapport d’aspect et les données de liste des régions de sélection d’intérêt.
Ici, des images représentatives des adhérences focales comptées avec ImageJ, y compris les contours numérotés finaux et les superpositions des contours d’adhérence focale avec l’image originale pour les lignes cellulaires de contrôle et de knockdown peuvent être observées. Comme illustré dans cette analyse, les cellules knockdown ont démontré un plus grand nombre d’adhérences par cellule aussi bien que des adhérences qui sont plus grandes dans la taille comparée aux cellules de ligne de cellules de contrôle. Dans ces images, des régions représentatives de monocouches cellulaires non traitées et traitées par chimiothérapie sont montrées.
Les cellules de contour ont été caractérisées en fonction de leurs valeurs d’index de forme cellulaire, par exemple dans cette analyse montrant une augmentation dans le dernier bac et un aplatissement des pics principaux pour les cellules médicamenteuses par rapport aux contrôles non traités. Une distribution de fréquences et une distribution cumulative pourraient alors être générées pour chaque culture cellulaire. L’imagerie à échelle grise des monocouches, telle qu’elle a été démontrée, a permis l’analyse et la quantification de 512 cellules provenant de 12 champs de vision révélant une répartition relative de la fréquence de l’indice de forme cellulaire.
Pour que ce protocole fonctionne, il est important d’utiliser des images de la meilleure qualité possible. Un ensemencement, une coloration et une imagerie cellulaires appropriés devraient assurer des images d’une qualité expérimentale suffisante.
