يساعد هذا البروتوكول على تأسيس الصلة بين القوة الجزيئية وسلوك المتداول الخلوي إلى جانب السماح برسم خريطة مكانية وتحديد التصاق المتداول على المستوى الجزيئي. تسمح هذه التقنية بدراسة أحداث التصاق الفردية أثناء تدحرج الخلية الفعلية مما يسمح لنا بقياس قوة الالتصاق الجزيئي الفسيولوجية ذات الصلة مباشرة. يعد إعداد السطح باستخدام وقت التركيز والحضانة المناسب في كل خطوة أمرا حاسما لتحقيق وظيفية سطحية عالية الجودة.
كما أن نوعية الأحكام البيولوجية والظروف المناسبة هي أيضا مسألة حاسمة. تعتبر المظاهرة البصرية حاسمة لمساعدة الباحثين على تكرار هذا البروتوكول. على وجه الخصوص ، فإن خطوات مثل تجميع غرفة التدفق وصور ما بعد المعالجة ستستفيد بشكل كبير من العرض التوضيحي المرئي.
تبدأ بنشر رقيقة كمية صغيرة من الايبوكسي على جانبي الشريط على الوجهين مع شفرة حلاقة. باستخدام الليزر، وقطع الشريط المغلفة الايبوكسي لإنشاء أربع قنوات. إنشاء رقاقة تدفق عن طريق شطيرة الشريط الايبوكسي بين شريحة من أربعة حفرة وأغطية PEG.
باستخدام طرف ماصة، وتطبيق ضغط لطيف على طول القنوات لخلق ختم جيدة، ثم علاج الايبوكسي لمدة ساعة واحدة على الأقل. قم بمحاذاة الشريحة بحيث يتم وضع فتحة كل قناة في مراكز المحول. ثم ضع اثنين من الفواصل الاكريليك شفافة على رأس رقاقة.
تطبيق ضغط ثابت في منتصف كتلة والمسمار في نهايات كل فاصل. المسمار مداخل في الثقوب مترابطة على الجانب الآخر من قوس ورصد حالة الختم من خلال كتلة الاكريليك شفافة. تدفق 200 ميكرولتر من العازلة غسل في الغرفة للتحقق من وجود تسرب.
إذا تشكلت الفقاعات في القناة ، فادفع بقوة 200 ميكرولتر إضافي من مخزن الغسيل لإزالة الفقاعات. أضف 40 ميكرولتر من BSA إلى غرفة التدفق لمنع الربط غير المحدد واحتضانه لمدة 10 دقائق في غرفة الرطوبة. بعد الحضانة، أضف 40 ميكرولتر في توين 20 إلى غرفة التدفق واحتضن مرة أخرى لمدة 10 دقائق لزيادة تقليل الربط غير المحدد.
ثم غسل القناة مع 200 ميكرولتر من العازلة غسل لإزالة جميع وكلاء يفرز. لسطح الغرفة الوظيفية، إضافة 40 ميكرولتر من ستريبتافيدين إلى غرفة التدفق واحتضان لمدة 20 دقيقة، ثم غسل الغرفة مع 200 ميكرولتر من العازلة غسل. الآن، إضافة 40 ميكرولتر من البروتين الهجين G-TGT إلى غرفة التدفق واحتضان لمدة 20 دقيقة.
بعد الغسيل مع عازلة غسل، إضافة 40 ميكرولتر من البروتين G-TGT حبلا أعلى واحتضان لمدة 20 دقيقة لإكمال أي حبلا أسفل TGT غير المخمورة على السطح ومن ثم غسل مع عازلة غسل. وأخيرا، إضافة 40 ميكرولتر من P-selectin-Fc إلى غرفة التدفق واحتضان لمدة 60 دقيقة قبل الغسيل مع عازلة غسل. ملء حقنة زجاجية خمسة ملليلتر مع المخزن المؤقت المتداول والاستفادة من جانبي الحقنة لطرد ودفع الفقاعات لأنها تطفو نحو الطرف.
بعد إدخال إبرة معقمة في قطعة 200 ملليمتر من أنابيب البولي إيثيلين، قم بتوصيل الإبرة بحقنة زجاجية. إصلاح المحاقن على مضخة حقنة وإمالة مضخة حقنة بحيث يتم رفع الجانب المكبس لمنع فقاعات الهواء من دخول القناة. أدخل نهاية الأنبوب في مدخل غرفة التدفق.
أدخل نهاية قطعة أخرى من أنابيب البولي إيثيلين مقاس 200 ملليمتر في المنفذ واغمر الطرف الآخر في كوب نفايات. خذ من ملليلتر إلى اثنين من عينة تعليق الخلية والطرد المركزي لكريات الخلايا. إزالة المتوسطة وإعادة إنفاق الخلايا بلطف في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المتداول.
قطع بعناية الأنابيب من مداخل ومنفذ وماصة 40 ميكرولتر من تعليق الخلية في غرفة التدفق. إعادة توصيل الأنابيب كما هو موضح سابقا ضمان عدم إدخال فقاعات في قناة التدفق. بدء تجربة المتداول الخلية عن طريق بدء مضخة حقنة بمعدلات التدفق المطلوب.
مراقبة المتداول الخلية باستخدام مجهر حقل الظلام مع هدف 10X. بمجرد الانتهاء من التجربة، قم بإزالة الخلايا من القناة عن طريق غرس المخزن المؤقت المتداول بمعدل 100 ملليلتر في الساعة حتى يصبح السطح خاليا من الخلايا. لتصوير المسارات المحلية بواسطة DNA-PAINT، أضف 40 ميكرولتر من حبلا صور DNA-PAINT المعدة في مخزن الحمض النووي PAINT إلى القناة.
إجراء مجهرية مضان الانعكاس الداخلي الكلي باستخدام الشروط المذكورة في المخطوطة النصية. ترجمة وتقديم الصور فائقة الدقة. لتصوير المسارات الطويلة عن طريق وضع العلامات الدائمة، أضف حبلا الصور الدائمة واحتضن لمدة 120 ثانية في المخزن المؤقت T50M5.
ثم غسل القناة عن طريق غرس 200 ميكرولتر من العازلة غسل. تسجيل صورة مع ليزر الإثارة قبالة للحصول على ضجيج الكاميرا الخلفية. صورة مساحة كبيرة في نمط الشبكة بواسطة المجهر TIRF.
برمجة المجهر لمسح أكثر من مساحة 400 من قبل 50 صورة وتقسيم البيانات الخام إلى ملفات TIP الفردية التي تحتوي على كل حد أقصى من 10،000 الصور باستخدام برنامج ImageJ. تسطيح جميع الصور باستخدام ملف الإضاءة واستخدام البرنامج المساعد MIST لغرزة الصور. وأظهرت نتيجة توصيف التكيف البيولوجي G ssDNA البروتين واحد تقريبا هو إلى نسبة واحدة من البروتين G إلى ssDNA حيث البروتين G Maleimide ssDNA وimidazole الأطياف العازلة الغذال من الأساس المتعامد لتركيبها مع طيف المنتج التعديل البيولوجي.
تم استخدام الصفحة الأصلية لتأكيد التعديل البيولوجي الذي يظهر النطاقات الخضراء الزاهية التي تتزامن مع نطاق البروتين G أحادية الألوان التي تشير إلى اقتران ناجح وغلة جيدة. ملف الإضاءة TIRF المقدمة من الألياف وضع واحد هو عموما أكثر إشراقا في منتصف مجال الرؤية وخفت حول حواف. للتعويض عن الإضاءة غير المستوية وتسوية الصور للتحليل الكمي ، تم تحديد ملف الإضاءة بمتوسط آلاف الإطارات الفردية.
تم إنتاج الصور المسطحة عن طريق طرح ضوضاء الكاميرا من كل من ملفات تعريف الخام والإضاءة ومن ثم تطبيعها من قبل ملف الإضاءة. وأظهرت الخياطة الخام أنماط دورية واضحة مطابقة للصور غير المصححة، في حين أن نفس مجال الرؤية مخيط من الصور بالارض أنتجت خلفية مسطحة. تم استخدام ملف تعريف التدفق المنحدر لتحديد نطاق إجهاد القص مما أدى إلى المتداول الخلوي والمسارات الفلورية العائدة التي يمكن بموجبها رؤية بصمة التصاق نموذجية أحادية الخلية.
تظهر النتائج دون المستوى الأمثل والأمثل للمسارات الفلورية مع تباين غير كاف وكثافة المسار المفرطة وكثافة المسار المثلى والتباين والتصوير المحدود للحمود النووي PAINT. وقت الحضانة من أكثر من 60 دقيقة ضمان التشغيل السطحي والبناء السليم غرفة يمنع مرور الفقاعات التي تضر سطح وظيفية. ينطبق هذا الإجراء على التحليل الكمي للقوة الجزيئية المشاركة في التصاق المتداول ويسمح للباحثين بفهم السلوك المتداول لأنواع الخلايا المختلفة.
تسمح هذه التقنية للباحثين باستكشاف أسئلة جديدة تتعلق بأحداث الالتصاق السريع مما يؤدي إلى مزيد من التقدم في أبحاث جزيء واحد وعلم الأحياء الميكانيكية.
