فإن الكتاب أود أن نعترف NanoVentures أستراليا لدعم تمويل السفر والبروفيسور جون هايكوك على استضافتها جزئيا هذا البحث في جامعة شيفيلد والسيدة Jaimee ماين لمساعدتها أثناء التصوير.

1. الاتحاد الافريقي NRS إعداد ملاحظة: الاتحاد الافريقي NRS يمكن توليفها من قبل عدد من وصفات 16، أو تم شراؤها من البائعين التجارية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الكثافة البصرية الأولية (OD) من الحل الاتحاد الافريقي NR عبر أشعة فوق البنفسجية فيس التحليل الطيفي، من خلال تسجيل قيم الامتصاص من 300 نانومتر إلى 1،000 نانومتر مع قرار من 0.5-2 نانومتر. تختلف حجم من الحل لاستخدامها مع كفيت المتاحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم NP التركيز المولي الأولي مع مناسبة تقنية 17 (مثل الأشعة فوق البنفسجية فيس التحليل الطيفي، جسيم واحد الطيف بالحث كتلة البلازما، وانتقال المجهر الإلكتروني) أو استخدام القيم تركيز المقدمة من قبل البائع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الأسهم 5 مل عن طريق تمييع العينة الاتحاد الافريقي NR الأولية للتوصل الى OD = 1. للحصول على أفضل التكرار، والحفاظ على ثابت OD لجميع العينات التي تم اختبارها. اتبع بروتوكول بائع التجاري لتركيبة المذيب تمييع. إذا لم تكن متأكدا، واستخدام الماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي 1 مل من محلول الاتحاد الافريقي NR مرتين لمدة 15 دقيقة في 7،800 x ج لإزالة أي فائض الكيميائية من الحل. يمكن دورات الطرد المركزي تختلف في القوة والوقت (على سبيل المثال 20 دقيقة في 5،600 × ز) 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة supernatants واعادة تعليق في شمال ولاية أراكان في الماء منزوع الأيونات. كما إعادة علقت الجزيئات قد تشكل الحصى في الحل، إعدادهم يوميا للحصول على أفضل النتائج. بدلا من ذلك، تخزينها في الثلاجة لمدة لا تزيد عن 1 في الاسبوع. لا تجمد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل استخدام في ظل ظروف زراعة الخلايا، يصوتن الحل الاتحاد الافريقي NR لمدة 5 دقائق ثم تعقيم مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة (كثافة الأشعة فوق البنفسجية لا تقل عن 400 ميغاواط ∙ م -2 في 254 نانومتر). </li></ol> 2. NG108-15 الخلية العصبية الخط الثقافة والتمايز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لخلية ثقافة المتوسط، وإعداد 500 مل من معقم Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) تحتوي على 10٪ (ث / ت) مصل العجل الجنين (FCS)، 1٪ (ث / ت) L-الجلوتامين، 1٪(ث / ت) البنسلين / الستربتومايسين و 0.5٪ (ث / ت) الأمفوتريسين B. يمكن aliquoted ملاحق، وتخزينها في -20 ° C، وأضاف أن وسائل الإعلام في اليوم المطلوبة: ملاحظة. يمكن أن تكون مبردة مستنبت الخلية في حالة معقمة لمدة أقصاها 1 الشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على المدى المتوسط ​​تمايز الخلايا، وإعداد 50 مل من DMEM معقمة تحتوي على 1٪ (ث / ت) L-الجلوتامين، 1٪ (ث / ت) البنسلين / الستربتومايسين و 0.5٪ (ث / ت) الأمفوتريسين B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا العصبية NG108-15 في 10 مل من مستنبت الخلية في قوارير T75 المصنوعة من البوليسترين في حاضنة مع جو مرطب (5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية). عادة، البذور 1.5-2 × 10 5 خلايا في كل قارورة على أن يكون جاهزا في 3-4 أيام. تغيير ثقافة الخلية المتوسطة كل يومين. ملاحظة: لمنع الانجرافات وراثية أو الاختلاف، لا تستخدم الخلايا القديمة من مرور 21 للتجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما 70-80٪ متكدسة في الثقافة، وتغيير المتوسطة مع الطازج الحار مستنبت الخلية. ميكانيكيا فصل الخلايا عن طريق كنوك بلطفالملك أسفل القارورة متموجة. لا تستخدم التربسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 600 XG وإعادة تعليق بيليه خلية في 2 مل من المتوسط ​​الدافئة تمايز الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 2 × 10 4 خلية / سم 2 في زراعة الأنسجة البوليسترين 96 لوحة جيدا مع 200 ميكرولتر من تمايز الخلايا المتوسطة. احتضان التجربة لمدة 1 يوم في 5٪ CO 2/37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ما بين 3.2 × 10 9 -4.2 × 1 0 10 الجسيمات / مل من محلول الاتحاد الافريقي NR في يوم 2 واحتضان لمدة 24 ساعة إضافية. لا تقم بإضافة جزيئات لتجارب السيطرة. ملاحظة: كما عنصر تحكم بديلة والاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية مع ذروة امتصاص الطول الموجي متباينة بشكل جيد يمكن استخدامها لأغراض المقارنة 14. لسلوك الخلية أكثر اتساقا، والحفاظ على كثافة الخلية ثابتة وعدم تعديل السطح جيدا قبل البذر الخلية. </li></ol> 3. ثمرة neurite تعزيز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زوجانالليزر مع الألياف الضوئية وضع واحد (الفتحة العددية = 0.13) وإنهائه مع موصل الألياف (وصلات FC هي مريحة ومتوفرة عادة). قياس انتاج الطاقة الليزر مع السلطة متر القياسية. للحصول على أفضل النتائج، مباراة قمة الطول الموجي لليزر إلى الذروة مأكل الرنين من شمال ولاية أراكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 3 التالية حضانة NR، وتحديد موصل FC إلى البئر. أشرق عينات والمراقبة على RT لمدة 1 دقيقة في موجة مستمرة، للقوى الليزر المختلفة. السماح للثقافة والمضي قدما لمدة 3 أيام إضافية بنسبة 5٪ CO 2/37 ° C. كرر وأشعة الليزر مدة لا تقل عن 3 قياسات مستقلة. ملاحظة: مرة تشعيع مختلفة ويمكن اختيار الترددات النبض، اعتمادا على التطبيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تميز الليزر من حيث قطرها شعاع الليزر والإشعاع (W ∙ سم -2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمعيار واحد من الألياف واسطة، واستخدام NA = ن ∙ الخطيئة θ،حيث n هو معامل الانكسار للوسط في استخدام وθ هي الزاوية نصف من مخروط الضوء الخروج من الألياف (انظر الشكل 1A). من علم المثلثات، ص = تان θ ∙ د، حيث r هو نصف قطر شعاع ود هي المسافة بين الألياف والعينة. موصل FC مباريات قطر البئر، وبالتالي إلقاء الضوء على عينة على مسافة ود = 2.70 ± 0.20 ملم. ضوء يخرج من الألياف في الماء (ن = 1.33)، وإعطاء ص = تان (الخطيئة-1 (NA / ن)) ∙ د. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المعادلة الأخيرة، وحساب نصف قطر شعاع الليزر، ومنطقة شعاع المقابلة ومتوسط ​​الإشعاع الليزر (قوة الليزر مقسوما على مساحة شعاع) على الهدف (انظر المثال الرسم البياني في الشكل 1B). هذه القيم تمثل متوسط ​​الإشعاع على المنطقة المضاءة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم الأخطاء للقياسات مع النظرية العامة للنشر الخطأ. ملاحظة: المسافة وبإلى صف موصل FC والعينة يمكن أن يقاس صورا للترتيب التجريبي ومرحلة ما بعد المعالجة من الصورة باستخدام البرمجيات المناسبة (مثل يماغيج). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 5، وإزالة تمايز الخلايا المتوسطة من التجارب وتحديد العينات مع 3.7٪ (V / V) حل الفورمالديهايد لمدة 10 دقيقة، ثم permeabilize الخلايا مع 0.1٪ (V / V) تريتون X-100 لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3٪ (ث / ت) ألبومين المصل البقري (BSA) للعينات لمدة 60 دقيقة لقطع الطريق على غير المتفاعل البروتين مواقع الربط. تسمية عينات ليلة وضحاها مكافحة βIII تويولين (5 ميكروغرام / مل في PBS تستكمل مع 1٪ من BSA) في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 90 دقيقة في الظلام مع الأجسام المضادة الثانوية المناسب (على سبيل المثال TRITC مترافق المضادة للماوس مفتش الأضداد) باستخدام تركيز 0،4-2 ميكروغرام / مل في 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني. تسمية نواة الخلية مع دابي (0.1 ميكروغرام / مل في المياه غير المتأينة) لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: اقتران الأجسام المضادة وتركيز MIGحزب التحرير تختلف وفقا لبروتوكول الشركة. عينات غسل مع PBS مرتين لمدة 5 دقائق بعد كل مرحلة تلطيخ. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52566/52566fig1.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الصورة عن طريق epifluorescence أو المجهري متحد البؤر باستخدام ما لا يقل عن 20 × الهدف. اختر المجهر مرشحات فقا لذلك إلى الضد الثانوية. اختر مرشح دابي (λ = 358 نانومتر EX، λ EM = 488 نانومتر) لتصور نواة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الصور من خلال تقييم: أ) الحد الأقصى للطول محوار (سجل طول من غيض من محوار إلى بداية خلايا الجسم)، والثاني) عدد neurites التي لكل خلية العصبية (تلخيص كل من neurites التي لكل خلية) والثالث) النسبة المئوية للخلايا مع neurites التي (تقسيم العدد الكلي للخلايا معربا عن βIII تويولين من العدد الكلي للخلايا مع نواة ملطخة إيجابا) 19. </li></ol> التي يسببها الليزر 4. الكالسيوم داخل الخلايا 2+ التصوير <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 20٪ (ث / ت) محلول المخزون من Pluronic F-127 عن طريق إذابة 2 غرام من المذاب في 10 مل من اللامائية سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO). تسخين حل Pluronic F-127 عند 40 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة إلى زيادة القابلية للذوبان. إعداده مسبقا في حال تخزينها في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 3 التالية NR الحضانة، وإعداد محلول ملحي متوازن (BSS، 135 مم كلوريد الصوديوم، 4.5 ملي بوكل، 1.5 ملي CaCl 2، 0.5 ملي MgCl 2، 5.6 ملي الجلوكوز، و 10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4) وتستكمل مع 5 ميكرومتر من فلوو-04:00 في DMSO و 0.1٪ (ث / ت) من Pluronic F-127 الحل. ملاحظة: حل BSS يمكن أن تكون معدة مسبقا والمبردة لمدة أقصاها 1 الشهر. إضافة المكملات الغذائية (فلوو-4 صباحا لPluronic F-127) في يوم التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تمايز الخلايا المتوسطة واستبدالها مع حل BSS تستكمل. للحصول على أفضل النتائج مع المجهر متحد البؤر المقلوب، واحتضان الخلايا في شريحة صغيرة أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل NG108-15 الخلايا مع فلوو-04:00لمدة 30 دقيقة في الظلام في 5٪ CO 2/37 ° C. وبعد فترة حضانة، وغسل العينات مرتين مع BSS لإزالة أي fluorophore تفريغ خارج الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زوجين الليزر مع الألياف الضوئية وضع واحد ويلتصق طرف باستخدام التقنيات القياسية. مراقبة غيض مما أدى تحت المجهر الضوئي، لضمان سطح ذات جودة عالية (أي يجب أن يكون طرف عمودي على محور الألياف وشقة على التفتيش المجهري). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس انتاج الطاقة الليزر مع السلطة متر القياسية. إدراج الألياف تسليم خفيفة إلى حامل الألياف الضوئية ويضعوا ذلك إلى micropositioner. الرجوع الى براون وآخرون. (20) لمزيد من التفاصيل حول إعداد الألياف البصرية وتحديد المواقع. تحذير: اتبع القواعد العامة للسلامة الليزر خلال قياس قوة الليزر (على سبيل المثال لا تنظر مباشرة إلى شعاع الليزر، وارتداء نظارات السلامة الليزر خلال المناولة، ومنع التعرض الضوء الشارد للمستخدمين معامل أخرى) &lt;./ لى&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل الذبذبات إلى ليزر محمول لمراقبة التشكيل البصري. استخدام إشارة الثنائية مع ترددات متغيرة (0.5-2 هرتز) وأطوال نبض (20-100 ميللي ثانية). ربط ليزر باستخدام إشارة التشكيل كما الترانزستور الترانزستور المنطق (TTL) مدخلات لالمجهر، وبعد الإعداد هو مبين في Paviolo وآخرون. 13. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الخلايا تحت المجهر مبائر مقلوب وموقف تسليم الألياف الخفيفة 250 ± 50 ميكرون بعيدا عن الخلية المستهدفة في وضع الإضاءة الإرسال. في هذه المسافة، استخدم المعادلات الواردة في 3.3.1 لحساب نصف قطر شعاع على الهدف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الليزر الأرجون ايون (488 نانومتر) لإثارة المنضوية فلوو-04:00 صبغ (λ = 494 نانومتر EX، λ EM = 516 نانومتر) وLD متزامنة لالإثارة من NRS endocytosed. أداء التصوير في RT العينات وضوابط استخدام ما لا يقل عن 40 × الهدف من خلال جمع السلاسل الزمنية بالاشعةمع 256 × 256 بكسل / قرار الإطار في وضع توصيل مع تواتر لا يقل عن 4 هرتز. إجراء تسجيل دون أي إثارة LD لتحديد أي تدخل ليزر الأرجون أيون (الضوضاء خط الأساس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلفية من البيانات باستخدام المرجحة بتكيف المربعات الصغرى يعاقب خوارزميات 21. رسم يسببها الكالسيوم 2+ الاختلافات بوصفها وظيفة من الزمن. تحليل قمم عابرة في كثافة مضان باستخدام صورة مرحلة ما بعد المعالجة البرنامج من قبل العتبة عند مستوى ثلاثة أضعاف الانحراف المعياري للضوضاء خط الأساس (3σ). </li></ol>

<ol>
	<li>Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stimulation+with+optical+radiation.">Neural stimulation with optical radiation.</a> Laser. Photonics Rev. 5 (1), 68-80 (2011).</li><li>Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+transients+evoked+by+pulsed+infrared+radiation+in+neonatal+cardiomyocytes.">Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes.</a> J. Physiol. 589 (6), 1295-1306 (2011).</li><li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+light+absorption+in+tissue+during+infrared+neural+stimulation.">Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation.</a> J. Biomed. Opt. 17 (7), 075002-075002 (2012).</li><li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+temporal+effects+of+heating+during+infrared+neural+stimulation.">Modeling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation.</a> J. Biomed. Opt. 18 (3), 035004 (2013).</li><li>Huang, H., Delikanli, S., Zeng, H., Ferkey, D. M., Pralle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+ion+channels+and+neurons+through+magnetic-field+heating+of+nanoparticles.">Remote control of ion channels and neurons through magnetic-field heating of nanoparticles.</a> Nat. Nanotechnol. 5 (8), 602-606 (2010).</li><li>Farah, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographically+patterned+activation+using+photo-absorber+induced+neural-thermal+stimulation.">Holographically patterned activation using photo-absorber induced neural-thermal stimulation.</a> J. Neural. Eng. 10 (5), (2013).</li><li>Ciofani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+neurite+outgrowth+in+neuronal-like+cells+following+boron+nitride+nanotube-mediated+stimulation.">Enhancement of neurite outgrowth in neuronal-like cells following boron nitride nanotube-mediated stimulation.</a> ACS Nano. 4 (10), 6267-6277 (2010).</li><li>Kim, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells+by+iron+oxide+nanoparticles.">Enhancement of neurite outgrowth in PC12 cells by iron oxide nanoparticles.</a> Biomaterials. 32 (11), 2871-2877 (2011).</li><li>Myroshnychenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+optical+response+of+gold+nanoparticles.">Modelling the optical response of gold nanoparticles.</a> Chem. Soc. Rev. 37 (9), 1792-1805 (2008).</li><li>Choi, W. I., Sahu, A., Kim, Y. H., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+cancer+therapy+and+imaging+based+on+gold+nanorods.">Photothermal cancer therapy and imaging based on gold nanorods.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (2), 534-546 (2011).</li><li>Zhan, Q., Qian, J., Li, X., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+mesoporous+silica-encapsulated+gold+nanorods+as+enhanced+light+scattering+probes+for+cancer+cell+imaging.">A study of mesoporous silica-encapsulated gold nanorods as enhanced light scattering probes for cancer cell imaging.</a> Nanotechnology. 21 (5), 055704 (2010).</li><li>Paviolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+exposure+of+gold+nanorods+can+increase+neuronal+cell+outgrowth.">Laser exposure of gold nanorods can increase neuronal cell outgrowth.</a> Biotechnol. Bioeng. 110 (8), 2277-2291 (2013).</li><li>Paviolo, C., Haycock, J. W., Cadusch, P. J., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+exposure+of+gold+nanorods+can+induce+intracellular+calcium+transients.">Laser exposure of gold nanorods can induce intracellular calcium transients.</a> J. Biophotonics. 7 (10), 761-765 (2014).</li><li>Yong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold-nanorod-assisted+near-infrared+stimulation+of+primary+auditory+neurons.">Gold-nanorod-assisted near-infrared stimulation of primary auditory neurons.</a> Adv. Healthcare Mater. , (2014).</li><li>Eom, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+infrared+neural+stimulation+using+localized+surface+plasmon+resonance+of+gold+nanorods.">Enhanced infrared neural stimulation using localized surface plasmon resonance of gold nanorods.</a> Small. , (2014).</li><li>Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marz&#225;n, L. M., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanorods:+Synthesis,+characterization+and+applications.">Gold nanorods: Synthesis, characterization and applications.</a> Coordination Chemistry Reviews. (17-18), 1870-1901 (2005).</li><li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+counting:+towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration.">Nanoparticle counting: towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chem. Soc. Rev. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li><li>Sharma, V., Park, K., Srinivasarao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+separation+of+gold+nanorods+using+centrifugation.">Shape separation of gold nanorods using centrifugation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (13), 4981-4985 (2009).</li><li>Kaewkhaw, R., Scutt, A. M., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+site+influences+the+differentiation+of+adipose-derived+stem+cells+for+schwann-cell+phenotype+and+function.">Anatomical site influences the differentiation of adipose-derived stem cells for schwann-cell phenotype and function.</a> Glia. 59 (5), 734-749 (2011).</li><li>Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+patch+clamp+for+investigating+the+mechanisms+of+infrared+neural+stimulation.">Whole cell patch clamp for investigating the mechanisms of infrared neural stimulation.</a> JoVE. (77), (2013).</li><li>Cadusch, P. J., Hlaing, M. M., Wade, S. A., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+for+fluorescence+background+subtraction+from+Raman+spectra.">Improved methods for fluorescence background subtraction from Raman spectra.</a> J. Raman Spectrosc. 44 (11), 1587-1595 (2013).</li><li>Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+aligned+3D+neuronal-glial+co-culture+model+for+peripheral+nerve+studies.">An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies.</a> Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+gold+nanoparticles+increase+neuronal+excitability+and+aggravate+seizure+activity+in+the+mouse+brain.">Intracellular gold nanoparticles increase neuronal excitability and aggravate seizure activity in the mouse brain.</a> PLoS ONE. 9 (3), e91360 (2014).</li><li>Salinas, K., Kereselidze, Z., DeLuna, F., Peralta, X., Santamaria, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+extracellular+application+of+gold+nanostars+increases+hippocampal+neuronal+activity.">Transient extracellular application of gold nanostars increases hippocampal neuronal activity.</a> J. Nanobiotechnology. 12 (1), 31 (2014).</li><li>Ebbesen, C. L., Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+laser-induced+heating+in+optical+neuronal+guidance.">Analysis of laser-induced heating in optical neuronal guidance.</a> J. Neurosci. Meth. 209 (1), 168-177 (2012).</li><li>Iwanaga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location-dependent+photogeneration+of+calcium+waves+in+HeLa+cells.">Location-dependent photogeneration of calcium waves in HeLa cells.</a> Cell Biochem. Biophys. 45 (2), 167-176 (2006).</li><li>Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+minimum+temperature+required+for+selective+photothermal+destruction+of+cancer+cells+with+the+use+of+immunotargeted+gold+nanoparticles.">Determination of the minimum temperature required for selective photothermal destruction of cancer cells with the use of immunotargeted gold nanoparticles.</a> Photochem. Photobiol. 82 (2), 412-417 (2006).</li><li>Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles+are+taken+up+by+human+cells+but+do+not+cause+acute+cytotoxicity.">Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity.</a> Small. 1 (3), 325-327 (2005).</li><li>Isomaa, B., Reuter, J., Djupsund, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subacute+and+chronic+toxicity+of+cetyltrimethylammonium+bromide+(CTAB),+a+cationic+surfactant,+in+the+rat.">The subacute and chronic toxicity of cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), a cationic surfactant, in the rat.</a> Arch. Toxicol. 35 (2), 91-96 (1976).</li><li>Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marz&#225;n, L., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanorods:+synthesis,+characterization+and+applications.">Gold nanorods: synthesis, characterization and applications.</a> Coord. Chem. Rev. 249 (17-18), 1870-1901 (2005).</li><li>Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+golden+age:+gold+nanoparticles+for+biomedicine.">The golden age: gold nanoparticles for biomedicine.</a> Chem. Soc. Rev. 41 (7), 2740-2779 (2012).</li><li>Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmonic+photothermal+therapy+(PPTT)+using+gold+nanoparticles.">Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles.</a> Lasers Med. Sci. 23 (3), 217-228 (2008).</li><li>Albert, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+channels+mediate+the+infrared+laser-evoked+response+in+sensory+neurons.">TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons.</a> J. Neurophysiol. 107 (12), 3227-3234 (2012).</li><li>Garcia-Elias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent+rearrangement+of+TRPV4+cytosolic+tails+enables+channel+activation+by+physiological+stimuli.">Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent rearrangement of TRPV4 cytosolic tails enables channel activation by physiological stimuli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9553-9558 (2013).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nat. Commun. 3 (736), (2012).</li><li>Roggan, A., Friebel, M., D&#246;rschel, K., Hahn, A., M&#252;ller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+properties+of+circulating+human+blood+in+the+wavelength+range+400-2500+nm.">Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm.</a> J. Biomed. Opt. 4 (1), 36-46 (1999).</li><li>Byrnes, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+promotes+regeneration+and+functional+recovery+and+alters+the+immune+response+after+spinal+cord+injury.">Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury.</a> Lasers Surg. Med. 36 (3), 171-185 (2005).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=810+nm+wavelength+light:+an+effective+therapy+for+transected+or+contused+rat+spinal+cord.">810 nm wavelength light: an effective therapy for transected or contused rat spinal cord.</a> Lasers Surg. Med. 41 (1), 36-41 (2009).</li><li>Grossman, N., Schneid, N., Reuveni, H., Halevy, S., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=780+nm+low+power+diode+laser+irradiation+stimulates+proliferation+of+keratinocyte+cultures:+involvement+of+reactive+oxygen+species.">780 nm low power diode laser irradiation stimulates proliferation of keratinocyte cultures: involvement of reactive oxygen species.</a> Lasers Surg. Med. 22 (4), 212-218 (1998).</li><li>Wong-Riley, M. T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiomodulation+directly+benefits+primary+neurons+functionally+inactivated+by+toxins+-+Role+of+cytochrome+c+oxidase.">Photobiomodulation directly benefits primary neurons functionally inactivated by toxins - Role of cytochrome c oxidase.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4761-4771 (2005).</li><li>Beauvoit, B., Kitai, T., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+mitochondrial+compartment+to+the+optical+properties+pf+the+rat+liver:+a+theoretical+and+practical+approach.">Contribution of the mitochondrial compartment to the optical properties pf the rat liver: a theoretical and practical approach.</a> Biophys. J. 67 (6), 2501-2510 (1994).</li></ol>

The authors have no competing interests to disclose.

البروتوكولات المذكورة في هذا العرض التقديمي تصف كيفية الثقافة والتفريق وبصريا تحفيز الخلايا العصبية باستخدام امتصاص خارجي. خصائص NR (على سبيل المثال الأبعاد والشكل والطول الموجي صدى مأكل والكيمياء السطحية) والمعلمات التحفيز ليزر (مثل الطول الموجي، طول النبض، و...

وقد أثبتت الدراسات الحديثة أن التدفئة عابرة المرتبطة امتصاص الأشعة تحت الحمراء عن طريق المياه (الطول الموجي&gt; 1،400 نانومتر) يمكن أن تستخدم للحث على إمكانات العمل في الأعصاب الأنسجة 1 و العابرين الكالسيوم داخل الخلايا العضلية في 2. وأثار استخدام الأشعة تحت الحمراء اهتماما كبيرا لتقديم الطلبات في الأطراف الاصطناعية العصبية، نظرا لدقة القرار المكانية المحتملين، وعدم وجود اتصال مباشر مع الأنسجة، والتقليل من القطع الأثرية التحفيز، وإزالة الحاجة إلى تعديل وراثيا الخلايا السابقة لتحفيز ( كما هو مطلوب في علم البصريات الوراثي) 1. على الرغم من كل هذه المزايا، تشير النماذج الحرارية وضعت مؤخرا أن الهدف الأنسجة / الخلايا قد تتأثر الآثار التدفئة التراكمي، عندما تستخدم مواقع التحفيز متعددة و / أو الرسوب عالية 3،4. واستجابة لهذه التحديات، وقد اعترفت الباحثون إمكانية استخدام absor خارجياأفراد لتحفيز العصب لإنتاج آثار أكثر محلية التدفئة في الأنسجة. هوانغ آخرون أثبت هذا المبدأ من خلال استخدام الجسيمات النانوية الفريت مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic لتنشيط عن بعد القنوات TRPV1 حساسة للحرارة في HEK 293 الخلايا مع الترددات الراديوية المجال المغناطيسي 5. على الرغم من أن هذه التقنية قد تسمح لاختراق أعمق (المجالات المغناطيسية تتفاعل ضعيفة نسبيا مع الأنسجة)، وسجلت ردود فقط على مدى فترات من ثانية، بدلا من فترات ميلي ثانية واحدة المطلوبة في أجهزة الكترونية 5. وبالمثل، فرح وآخرون التحفيز الكهربائي أثبتت من العصبونات القشرية الفئران السوداء مع الجسيمات الدقيقة في المختبر. أظهروا الدقة على مستوى خلية في التحفيز باستخدام فترات نبض بناء على أمر من مئات ميكرو ثانية والطاقات في نطاق μJ، ويحتمل أن السماح لأسرع معدلات الرسوب 6. كما تم تطبيق استخدام ماصات خارجي للحثتغيرات شكلية في المختبر. أظهر Ciofani وآخرون زيادة ~ 40٪ في نمو الخلايا العصبية باستخدام كهرضغطية الأنابيب النانوية نيتريد البورون متحمس بواسطة الموجات فوق الصوتية (7). وبالمثل، تم الإبلاغ عن endocytosed جزيئات أكسيد الحديد في الخلايا PC12 لتعزيز محوار التمايز بطريقة تعتمد على الجرعة، ويرجع ذلك إلى تفعيل جزيئات التصاق الخلية مع أكسيد الحديد 8. في الآونة الأخيرة، ركزت اهتمامها امتصاص خارجي لمساعدة التحفيز العصبي أيضا على استخدام جزيئات الذهب (الاتحاد الافريقي NPS). الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية لديها القدرة على استيعاب بكفاءة ضوء الليزر في ذروة plasmonic وتبدد ذلك في البيئة المحيطة بها في شكل حرارة 9. بين كافة الأشكال الجسيمات المتاحة، وامتصاص البصرية من نانواعواد الذهب (الاتحاد الافريقي NRS) مباريات مريح النافذة العلاجية من الأنسجة البيولوجية (بالقرب من الأشعة تحت الحمراء - الجرد الوطني، والطول الموجي بين 750-1،400 نانومتر) 10. وعلاوة على ذلك، في تتمةتحويلة من التحفيز العصبي، واستخدام الاتحاد الافريقي NRS يوفر توافق مع الحياة مواتية نسبيا ومجموعة واسعة من الخيارات functionalization سطح 11. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن تأثير تنشيطية على التمايز يمكن أن يتسبب التعرض ليزر بعد متواصلة من الاتحاد الافريقي في شمال ولاية أراكان NG108-15 الخلايا العصبية (12). وبالمثل، سجلت العابرين الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا العصبية مثقف مع الاتحاد الافريقي NRS بعد أشعة الليزر التضمين مع ترددات متغيرة والنبض أطوال 13. كما تم تسجيل الاستقطاب غشاء الخلية بعد NIR إضاءة ليزر من الاتحاد الافريقي NRS في الثقافات الأولية من الخلايا العصبية العقدية الحلزونية 14. الأولى من نوعها في تطبيق الجسم الحي مع المشع الاتحاد الافريقي NRS وقد ثبت مؤخرا. بعثة مراقبة الانتخابات وزملاء العمل كشفت الاتحاد الافريقي NRS في ذروتها plasmonic وسجلت زيادة ستة أضعاف في السعة من إمكانات العمل المركب العصبية (CNAPs) وانخفاض ثلاثة أضعاف في العتبة التحفيز في الفئران الأعصاب الوركي. وENويعزى استجابة تعزيز نسبة إلى آثار التدفئة المحلية الناتجة عن الإثارة من NR plasmonic الذروة 15. في هذه الورقة، يتم تحديد بروتوكولات للتحقيق في آثار التحفيز الليزر في NG108-15 الخلايا العصبية مثقف مع NRS الاتحاد الافريقي. هذه الطرق توفر بسيطة، لكنها قوية، وسيلة لأشرق السكان الخلية في المختبر باستخدام التقنيات والمواد البيولوجية القياسية. ويستند هذا البروتوكول على الصمام الثنائي ليزر إلى جانب الألياف (LD) التي تسمح التشغيل الآمن والمواءمة للتكرار. إعداد العينة والليزر طرق التشعيع الاتحاد الافريقي NR يمكن تمديد أيضا على الأشكال الجسيمات المختلفة والثقافات الخلية العصبية، التي تنص على أن البروتوكولات التوليف وثقافة محددة معروفة، على التوالي.

<table><tbody><tr><td>Au NR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>716812</td><td></td></tr><tr><td>NG108-15</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8811230</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6546</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Life Technologies</td><td>10100147</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Life Technologies</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BDH</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&amp;beta;III-tubulin</td><td>Promega</td><td>G7121</td><td></td></tr><tr><td>TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5393</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spectrometer</td><td>Varian Medical Systems Inc.</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Mini Spin</td><td></td></tr><tr><td>Sonic bath</td><td>Unisonics Australia</td><td>FPX 10D</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Kendro</td><td>Hera Cell 150</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture centrifuge</td><td>Hettich</td><td>Rotofix 32A</td><td></td></tr><tr><td>Laser diode</td><td>Optotech</td><td>780 nm single mode fibre - coupled LD</td><td></td></tr><tr><td>Optical fiber</td><td>Thorlabs</td><td>780 HP</td><td></td></tr><tr><td>Power meter</td><td>Coherent</td><td>Laser Check</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescent microscope</td><td>Axon Instruments</td><td>ImageX-press 5000A</td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;-slide well</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>Inverted confocal microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy Ltd.</td><td>LSM 510 meta-confocal microscope</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>TDS210</td><td></td></tr></tbody></table>

gold nanorod-assisted optical stimulation of neuronal cells

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.

باستخدام بروتوكولات 1، 2، و 3 وصفها هنا، لوحظ وجود تأثير تنشيطية على التمايز في الخلايا العصبية مثقف NG108-15 مع الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية (NRS الاتحاد الافريقي، وبولي (styrenesulfonate) -coated الاتحاد الافريقي NRS والمغلفة السيليكا الاتحاد الافريقي NRS) بعد الليزر التعرض ب...

Watch this Scientific Journal Video about Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells at JoVE.com

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

الذهب Nanorod بمساعدة تحفيز البصري من الخلايا العصبية

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

gold-nanorod-assisted-optical-stimulation-of-neuronal-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K Views.  Swinburne University of Technology. This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

Video: Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single cells in response to electrical or pharmacological manipulations1,2. With the invention of methods to optically control genetically targeted neurons (optogenetics), researchers now have an unprecedented level of control over specific groups of neurons in the standard slice preparation. In particular, photosensitive channelrhodopsin-2 (ChR2) allows researchers to activate neurons with light3,4. By combining careful calibration of LED-based photostimulation of ChR2 with standard slice electrophysiology, we are able to probe with greater detail the role of adult-born interneurons in the olfactory bulb, the first central relay of the olfactory system. Using viral expression of ChR2-YFP specifically in adult-born neurons, we can selectively control young adult-born neurons in a milieu of older and mature neurons. Our optical control uses a simple and inexpensive LED system, and we show how this system can be calibrated to understand how much light is needed to evoke spiking activity in single neurons. Hence, brief flashes of blue light can remotely control the firing pattern of ChR2-transduced newborn cells.

Adult-born neurons expressing ChR2 can be manipulated in slice electrophysiological preparations in order to examine their contribution towards the function of olfactory neural circuits.

بأسعار معقولة باستخدام صفائف الصمام لتحفيز الخلايا العصبية ، صور

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

الفيروسية تنبيغ الانتقائي للبالغين المولودين في الخلايا العصبية الشمية لالمزمنة في الجسم الحي تحفيز Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

الألياف الضوئية للزراعة تحفيز Optogenetic المزمن من أنسجة المخ

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Gold Nanoparticle Modified Carbon Fiber Microelectrodes for Enhanced Neurochemical Detection

For over 30 years, carbon-fiber microelectrodes (CFMEs) have been the standard for neurotransmitter detection. Generally, carbon fibers are aspirated into glass capillaries, pulled to a fine taper, and then sealed using an epoxy to create electrode materials that are used for fast scan cyclic voltammetry testing. The use of bare CFMEs has several limitations, though. First and foremost, the carbon fiber contains mostly basal plane carbon, which has a relatively low surface area and yields lower sensitivities than other nanomaterials. Furthermore, the graphitic carbon is limited by its temporal resolution, and its relatively low conductivity. Lastly, neurochemicals and macromolecules have been known to foul at the surface of carbon electrodes where they form non-conductive polymers that block further neurotransmitter adsorption. For this study, we modify CFMEs with gold nanoparticles to enhance neurochemical testing with fast scan cyclic voltammetry. Au3+ was electrodeposited or dipcoated from a colloidal solution onto the surface of CFMEs. Since gold is a stable and relatively inert metal, it is an ideal electrode material for analytical measurements of neurochemicals. Gold nanoparticle modified (AuNP-CFMEs) had a stability to dopamine response for over 4 h. Moreover, AuNP-CFMEs exhibit an increased sensitivity (higher peak oxidative current of the cyclic voltammograms) and faster electron transfer kinetics (lower &#916;EP or peak separation) than bare unmodified CFMEs. The development of AuNP-CFMEs provides the creation of novel electrochemical sensors for detecting fast changes in dopamine concentration and other neurochemicals at lower limits of detection. This work has vast applications for the enhancement of neurochemical measurements. The generation of gold nanoparticle modified CFMEs will be vitally important for the development of novel electrode sensors to detect neurotransmitters in vivo in rodent and other models to study neurochemical effects of drug abuse, depression, stroke, ischemia, and other behavioral and disease states.

In this study, we modify carbon-fiber microelectrodes with gold nanoparticles to enhance the sensitivity of neurotransmitter detection.

الذهب نانوجسيم تعديل الأقطاب الدقيقة ألياف الكربون لتعزيز الكشف العصبي الكيميائي

For over 30 years, carbon-fiber microelectrodes (CFMEs) have been the standard for neurotransmitter detection. Generally, carbon fibers are aspirated into ...

Chemistry

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

إعداد وتحليل الضوئي المركبات الخلوية تحتوي على الذهب نانواعواد

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

Bioengineering

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

مراقبة البصرية من الخلايا الحية النشاط الكهربائي من قبل مترافق البوليمرات

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

تحفيز Optogenetic من العصب السمعي

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These cell-silicon hybrids offer leadless optical modulation capabilities with minimal perturbation to normal cell behavior. The optical capabilities are obtained by the photothermal and photoelectric properties of SiNWs. These hybrids can be harvested using standard tissue culture techniques and then applied to different biological scenarios. We demonstrate here how these hybrids can be used to study the electrical coupling of cardiac cells and compare how myofibroblasts couple to one another or to cardiomyocytes. This process can be accomplished without special equipment beyond a fluorescent microscope with coupled laser line. Also shown is the use of a custom-built MATLAB routine that allows the quantification of calcium propagation within and between the different cells in the culture. Myofibroblasts are shown to have a slower electrical response than that of cardiomyocytes. Moreover, the myofibroblast intercellular propagation shows slightly slower, though comparable velocities to their intracellular velocities, suggesting passive propagation through gap junctions or nanotubes. This technique is highly adaptable and can be easily applied to other cellular arenas, for in vitro as well as in vivo or ex vivo investigations.

This protocol describes the use of silicon nanowires for intracellular optical bio-modulation of cell in a simple and easy to perform method. The technique is highly adaptable to diverse cell types and can be used for in vitro as well as in vivo applications.

أسلاك السيليكون النانوية والتحفيز البصري للتحقيقات من اقتران داخل وفيما بين الخلايا الكهربائية

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective neural modulation or monitoring. As specific types of neuronal cells can be genetically modified to express opsin proteins, optogenetics enables optical stimulation or inhibition of the selected neurons. There have been several technological advances in the optical system for optogenetics. Recently, it was proposed to combine the optical waveguide for light delivery with electrophysiological recording to simultaneously monitor the neural responses to optogenetic stimulation or inhibition. In this study, an implantable optrode array (2x2 optical fibers) was developed with embedded multichannel electrodes. 
A light-emitting diode (LED) was employed as a light source, and a microfabricated microlens array was integrated to provide sufficient light power at the tip of the optical fibers. The optrode array system comprises the disposable part and the reusable part. The disposable part has optical fibers and electrodes, while the reusable part has the LED and electronic circuitry for light control and neural signal processing. The novel design of the implantable optrode array system is introduced in the accompanying video in addition to the procedure of the optrode implantation surgery, optogenetic light stimulation, and the electrophysiological neural recording. The results of in vivo experiments successfully showed time-locked neural spikes evoked by the light stimuli from hippocampal excitatory neurons of mice.

Here, we present the fabrication method of an optrode system with optical fibers for light delivery and an electrode array for neural recording. In vivo experiments with transgenic mice expressing channelrhodopsin-2 show the feasibility of the system for simultaneous optogenetic stimulation and electrophysiological recording.

مصفوفة Optrode للتعديل البصري الوراثي المتزامن والتسجيل العصبي الكهربائي

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective ...