يجمع هذا البروتوكول بين التهجين الفلوري RNAscope في الموقع والكيمياء المناعية باستخدام مستحضرات الدماغ الطازجة المجمدة أو الثابتة. تسمح هذه التقنية بالمرونة من خلال إظهار مزيج من طرق التهجين عالية الحساسية في الموقع والكيمياء المناعية للتصور المكاني لأهداف الحمض النووي الريبي والبروتين في نفس عينة الأنسجة. هذه الطريقة قابلة للتطبيق لوضع العلامات المتعددة في قسم أنسجة المخ ، مما يساعد على التحقيق في التنظيم المكاني والأهمية الوظيفية ل mRNA والبروتينات داخل المجموعات العصبية غير المتجانسة في علم الأعصاب.
يركز هذا البروتوكول بشكل أساسي على خطوات معالجة الأنسجة الطازجة المجمدة والأنسجة الثابتة بارافورمالدهايد. لبدء تقسيم أنسجة المخ الطازجة المجمدة ، قم بتثبيتها على ظرف التبريد المبرد مسبقا وقطع مقاطع إكليلية بسمك 14 ميكرومتر. قم بتركيب القسم على شريحة مجهرية زجاجية مشحونة.
انقل الشريحة المثبتة إلى مربع شرائح. ثم انقل الصندوق إلى الفريزر بدرجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر على الثلج الجاف. لتثبيت الأنسجة ، قم بتصفية محلول بارافورمالدهايد المحضر.
تبريده إلى 4 درجات مئوية. أحضر الشريحة المثبتة من الفريزر بدرجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر على الثلج الجاف واغمرها على الفور في محلول بارافورمالدهايد المبرد مسبقا لمدة 15 دقيقة ، قم بتجفيف الأنسجة الطازجة المجمدة للتأكد من أن الشريحة الزجاجية جافة تماما. بعد إزالة الدماغ من حامل ثابت غزير عبر القلب ، باستخدام ميكروتوم يهتز ، قم بقطع أقسام الأنسجة بسمك 30 ميكرومتر.
قم بتخزين المقاطع المقطوعة في محلول واقي من التبريد. في يوم فحص FISH ، انقل القسم العائم الحر إلى لوحة استزراع خلية مكونة من 12 بئرا تحتوي على 0.1 مللي مول PBS وقم بتحريكها عند 90 إلى 100 دورة في الدقيقة على شاكر منصة دوارة لغسل مادة الحماية من التبريد. بعد ذلك ، باستخدام فرشاة الرسم ، قم بتركيب القسم بشكل مسطح على شريحة مجهرية زجاجية لمنع الانفصال أثناء الغسيل ، وجفف في الهواء لمدة ساعتين على الأقل.
باستخدام قلم حاجز كاره للماء ، ارسم حاجزا كارها للماء حول القسم لاحتواء كواشف FISH. بعد المعالجة المسبقة ، يتم تحضين الأنسجة في محلول البروتياز وتهجينها باستخدام مجسات RNAscope لمدة ساعتين وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، يتم تنفيذ خطوات التضخيم المتسلسل والكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية.
ابدأ بإعداد غرفة محمية بالضوء المرطب لاحتضان الشرائح. في حمام مائي ، قم بغسل المخزن المؤقت الدافئ 50X والمجسات إلى 40 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بمجرد تبريده إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بإعداد لتر واحد من المخزن المؤقت للغسيل 1X من تركيز المخزون 50X.
تحضير خليط المسبار كما هو موضح في المخطوطة النصية. لعلاج البروتيناز ، أضف البروتيناز 3 إلى قسم الأنسجة واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. لغسل البروتيناز ، اغمر الشريحة برفق في 0.1 مولار PBS في درجة حرارة الغرفة ، وتجنب إزاحة القسم.
للتهجين ، أضف خليط المسبار إلى قسم الأنسجة. ضعه في الغرفة المرطبة قبل تسخينها. ثم احتضانها لمدة ساعتين عند 40 درجة مئوية.
شطف قسم الأنسجة مع العازلة الغسيل مرتين لمدة دقيقتين. لتضخيم الإشارة ، باستخدام زجاجة قطارة ، أضف محلول تضخيم لتغطية قسم الأنسجة واحتضانه كما هو موضح في النص. أضف محلول الحجب إلى قسم الأنسجة واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لمنع الارتباط غير المحدد.
حرك الشريحة لإزالة المخزن المؤقت الزائد للحظر بعد الحضانة. الآن ، احتضن القسم بالأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل الشريحة ثلاث مرات باستخدام 1X TBS.
أضف الجسم المضاد الثانوي واحتضان الأقسام لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. افحص الشريحة تحت مجهر التألق الفائق المزود بكاميرا. احصل على صور تمثيلية بتكبير 20 مرة واحفظها كملفات TIF.
في الدراسة الحالية ، تم تأكيد جودة الأنسجة وسلامتها وغياب التلوث البكتيري من خلال عدم وجود علامات DAPI. أكد وضع العلامات من مجسات التحكم الإيجابية التي تستهدف يوبيكويتين C وببتيديل بروليل إيزوميراز B وبوليميراز الحمض النووي الريبي IIA mRNA سلامة الحمض النووي الريبي. في المستحضرات الطازجة المجمدة لتمييز الخلايا العصبية الإيجابية GalR1 mRNA داخل NTS ، تم استخدام علامات كيميائية عصبية إضافية.
تم تمييز الناقل الحويصلي المرتبط بالغشاء بوضوح. في المقابل ، لوحظت البروتينات السيتوبلازمية مثل هيدروكسيلاز التيروزين و GFP المعبر عنها تحت سيطرة مروج PHOX2B بشكل ضعيف ووصفت بأنها ندفية لأنها تفتقر إلى مخطط واضح. تم وضع علامات على مسبار GalR1 FISH للسيتوبلازم GalR1 mRNA وتمت ملاحظته بوضوح.
للتأكد من أن جودة الكيمياء الهيستولوجية المناعية تعتمد على توطين البروتين تحت الخلوي ، تم تصنيف بروتينات نووية وسيتوبلازمية مختلفة بالتوازي مع FISH في نفس أقسام الأنسجة. كان السيتوبلازم PHOX2B GFP مظهر ندفي. في حين أن إشارة البروتين النووي PHOX2B كانت واضحة ، والتي أكدت وضع علامات مناعية عالية الجودة عند دمجها مع FISH.
عند إجراؤها على أقسام مجمدة ثابتة بالاشتراك مع FISH ، كانت الكيمياء الهيستولوجية المناعية موثوقة بغض النظر عن التوطين تحت الخلوي. كانت الخلايا العصبية الإيجابية GlyT2 mRNA موجودة بطنية ل NTS وليس داخل NTS. لم تتزامن الخلايا العصبية الإيجابية ل GlyT2 mRNA و PHOX2B mRNA في التوطين.
كانت مجموعة فرعية من الخلايا العصبية NTS الإيجابية ل PHOX2B mRNA عبارة عن تيروزين هيدروكسيلاز مناعي ، ولم يحتوي أي منها على GlyT2 mRNA. يتيح RNAscope تصور وتحليل توزيع الحمض النووي الريبي بدقة جزيء واحد في الخلايا والأنسجة. إنه يمكن البحث في أنواع الحمض النووي الريبي الجديدة ، وآليات المرض ، وأنماط التعبير الجيني ، وتنوع الخلايا العصبية ، والتفاعلات الخلوية.
