Este protocolo combina fluorescência, RNAscope, hibridização in situ e imunohistoquímica usando preparações cerebrais frescas congeladas ou fixas. Esta técnica permite flexibilidade ao demonstrar uma combinação de métodos de hibridização in situ altamente sensíveis e imunohistoquímica para visualização espacial de alvos de RNA e proteínas em um mesmo espécime tecidual. Este método é aplicável para marcação multiplex em cortes de tecido cerebral, auxiliando na investigação da organização espacial e significado funcional de RNAm e proteínas dentro de populações neuronais heterogêneas em neurociência.
Este protocolo concentra-se principalmente nas etapas de processamento de tecido fresco congelado e tecido fixado com paraformaldeído. Para começar a seccionar o tecido cerebral recém-congelado, fixe-o no mandril de criostato pré-resfriado e corte seções coronais de 14 micrômetros de espessura. Monte a seção em uma lâmina de microscopia de vidro carregada.
Transfira o slide montado para uma caixa de slides. Em seguida, transporte a caixa para o congelador de 80 graus Celsius negativos em gelo seco. Para fixação do tecido, filtrar a solução preparada de paraformaldeído.
Resfriar a 4 graus Celsius. Traga a lâmina montada do congelador de 80 graus Celsius negativos sobre gelo seco e mergulhe-a imediatamente na solução de paraformaldeído pré-refrigerada por 15 minutos, Execute a desidratação do tecido fresco congelado para garantir que a lâmina de vidro esteja completamente seca. Depois de remover o cérebro de uma montagem fixa de profusão transcárdica, usando um micrótomo vibratório, corte cortes de tecido de 30 micrômetros de espessura.
Conservar as secções cortadas em solução crioprotetora. No dia do ensaio de FISH, transferir a seção de flutuação livre para uma placa de cultura celular de 12 poços contendo PBS 0,1 molar e agitá-la a 90 a 100 RPM em um agitador de plataforma giratória para lavar o crioprotetor. Em seguida, usando um pincel, monte a seção plana em uma lâmina de microscopia de vidro para evitar o descolamento durante as lavagens e seque ao ar por pelo menos duas horas.
Usando uma caneta de barreira hidrofóbica, desenhe uma barreira hidrofóbica ao redor da seção para conter os reagentes FISH. Após o pré-processamento, o tecido é incubado em solução de protease e hibridizado com sondas RNAscope por duas horas, de acordo com as diretrizes do fabricante. Em seguida, são realizadas as etapas de amplificação sequencial e imunohistoquímica por fluorescência.
Comece preparando uma câmara de proteção contra luz umidificada para incubar lâminas. Em banho-maria, aqueça o tampão de lavagem 50X e as sondas a 40 graus Celsius por 10 minutos. Uma vez resfriado à temperatura ambiente, prepare um litro de tampão de lavagem 1X a partir da concentração de estoque de 50X.
Prepare a mistura de sonda conforme descrito no manuscrito do texto. Para o tratamento com proteinases, adicionar proteinase 3 ao corte de tecido e incubá-lo à temperatura ambiente por 30 minutos. Para lavar a proteinase, mergulhe suavemente a lâmina em PBS 0,1 molar à temperatura ambiente, evitando o deslocamento da secção.
Para hibridização, adicionar a mistura de sonda sobre a seção de tecido. Coloque-o na câmara pré-aquecida umedificada. Em seguida, incube-o por duas horas a 40 graus Celsius.
Enxaguar a seção de tecido com tampão de lavagem duas vezes por dois minutos. Para amplificação do sinal, usando um frasco conta-gotas, adicione uma solução de amplificação para cobrir a seção de tecido e incubar conforme descrito no texto. Adicione a solução de bloqueio à secção do tecido e incube durante uma hora à temperatura ambiente para evitar a ligação inespecífica.
Deslize o slide para remover o excesso de buffer de bloqueio após a incubação. Agora, incube a seção com anticorpos primários durante a noite a 4 graus Celsius. No dia seguinte, lave a lâmina três vezes com 1X TBS.
Adicionar o anticorpo secundário e incubar as secções durante duas horas à temperatura ambiente. Examine a lâmina sob um microscópio de epifluorescência equipado com uma câmera. Adquira imagens representativas com ampliação de 20 vezes e salve-as como arquivos TIF.
No presente estudo, a qualidade tecidual, a integridade e a ausência de contaminação bacteriana foram confirmadas pela ausência de marcação DAPI. A marcação de sondas de controle positivo visando ubiquitina C, peptidilprolil isomerase B e RNA polimerase IIA mRNA confirmou a integridade do RNA. Em preparações recém-congeladas para distinguir neurônios positivos de RNAm de GalR1 dentro do NTS, marcadores neuroquímicos adicionais foram usados.
O transportador vesicular ligado à membrana estava claramente marcado. Em contraste, proteínas citoplasmáticas como tirosina hidroxilase e GFP expressas sob o controle do promotor PHOX2B foram fracamente observadas e descritas como floculentas por não possuírem um contorno claro. A marcação com sonda GalR1 FISH do mRNA citoplasmático de GalR1 foi puntiforme e claramente observada.
Para confirmar que a qualidade imunoistoquímica depende da localização subcelular da proteína, diferentes proteínas nucleares e citoplasmáticas foram marcadas em paralelo com FISH nos mesmos cortes teciduais. A GFP citoplasmática PHOX2B apresentou aspecto floculante. Já o sinal da proteína nuclear PHOX2B foi claro, o que confirmou a marcação imunológica de maior qualidade quando combinada com FISH.
Quando realizada em cortes fixos congelados em combinação com FISH, a imuno-histoquímica foi confiável, independentemente da localização subcelular. Os neurônios positivos para RNAm de GlyT2 estavam localizados ventralmente ao NTS e não dentro do NTS. Os neurônios positivos para mRNA GlyT2 e PHOX2B mRNA positivo não colocalizaram.
Uma subpopulação de neurônios NTS PHOX2B positivos para mRNA foi imunorreativa à tirosina hidroxilase, e nenhum continha mRNA de GlyT2. O RNAscope permite a visualização e análise da distribuição de RNA na resolução de uma única molécula em células e tecidos. Ele capacita a pesquisa em novas espécies de RNA, mecanismos de doenças, padrões de expressão gênica, diversidade de neurônios e interações celulares.
