该方案结合了荧光RNAscope原位杂交和免疫组化，使用新鲜冷冻或固定的脑制剂。该技术通过展示高灵敏度原位杂交和免疫组织化学方法的组合，实现同一组织标本中 RNA 和蛋白质靶标的空间可视化，从而实现灵活性。该方法适用于脑组织切片的多重标记，有助于研究神经科学中异质神经元群体中mRNA和蛋白质的空间组织和功能意义。
该协议主要侧重于新鲜冷冻组织和多聚甲醛固定组织的处理步骤。要开始切片新鲜冷冻的脑组织，请将其固定在预冷的低温恒温器卡盘上，并切割14微米厚的冠状切片。将切片安装到带电的玻璃显微镜载玻片上。
将安装的载玻片转移到载玻片盒中。然后将盒子运送到零下 80 摄氏度的干冰冰箱中。对于组织固定，过滤制备的多聚甲醛溶液。
冷却至4摄氏度。将安装好的载玻片从零下80摄氏度的冰箱中取出，放在干冰上，立即将其浸入预冷的多聚甲醛溶液中15分钟，对新鲜冷冻的组织进行脱水，以确保载玻片完全干燥。从经心积血固定支架上取出大脑后，使用振动切片机切割 30 微米厚的组织切片。
将切割部分储存在冷冻保护剂溶液中。在FISH测定当天，将自由浮动部分转移到含有0.1摩尔PBS的12孔细胞培养板中，并在旋转平台振荡器上以90至100RPM搅拌以洗去冷冻保护剂。然后，使用画笔将切片平放在玻璃显微镜载玻片上，以防止洗涤过程中脱落，并风干至少两个小时。
使用疏水屏障笔，在切片周围绘制疏水屏障以容纳FISH试剂。预处理后，将组织在蛋白酶溶液中孵育，并按照制造商的指南与RNAscope探针杂交两小时。然后，进行连续扩增步骤和荧光免疫组化。
首先准备一个加湿的避光室，用于孵育载玻片。在水浴中，将 50X 洗涤缓冲液和探头加热至 40 摄氏度 10 分钟。冷却至室温后，从 50X 原液浓度中制备 1 升 1X 洗涤缓冲液。
按照文本手稿中的说明制备探针混合物。对于蛋白酶处理，将蛋白酶 3 添加到组织切片上，并在室温下孵育 30 分钟。为了洗掉蛋白酶，在室温下将载玻片轻轻浸入0.1摩尔PBS中，避免切片移位。
对于杂交，将探针混合物添加到组织切片上。将其放入加湿的预热室中。然后在 40 摄氏度下孵育两个小时。
用洗涤缓冲液冲洗组织部分两次，每次两分钟。对于信号放大，使用滴管瓶，加入扩增溶液以覆盖组织部分并按照文中所述孵育。将封闭溶液添加到组织切片上，并在室温下孵育一小时，以防止非特异性结合。
孵育后轻弹载玻片以除去多余的封闭缓冲液。现在，将切片与一抗在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，用 1X TBS 清洗载玻片三次。
加入二抗，并在室温下孵育切片两小时。在配备有相机的落射荧光显微镜下检查载玻片。以 20 倍放大倍率采集具有代表性的图像并将其保存为 TIF 文件。
在本研究中，通过没有 DAPI 标记来确认组织质量、完整性和无细菌污染。靶向泛素 C、肽基脯氨酰异构酶 B 和 RNA 聚合酶 IIA mRNA 的阳性对照探针的标记证实了 RNA 的完整性。在新鲜冷冻制剂中，为了区分NTS内的GalR1 mRNA阳性神经元，使用了额外的神经化学标志物。
膜结合的囊泡转运蛋白被清楚地标记。相比之下，在PHOX2B启动子控制下表达的细胞质蛋白（如酪氨酸羟化酶和GFP）被微弱地观察到并被描述为絮状蛋白，因为它们缺乏清晰的轮廓。GalR1 FISH探针标记细胞质GalR1 mRNA呈点状，观察清晰。
为了确认免疫组化质量取决于蛋白质亚细胞定位，在相同的组织切片中用 FISH 平行标记不同的细胞核和细胞质蛋白。细胞质PHOX2B GFP具有絮状外观。而核 PHOX2B 蛋白信号清晰，这证实了与 FISH 联合使用时更高质量的免疫标记。
当与FISH联合在固定冰冻切片上进行时，无论亚细胞定位如何，免疫组化都是可靠的。GlyT2 mRNA阳性神经元位于NTS的腹侧，而不是NTS内。GlyT2 mRNA 阳性和 PHOX2B mRNA 阳性神经元不共定位。
PHOX2B mRNA 阳性 NTS 神经元的一个亚群具有酪氨酸羟化酶免疫反应性，并且没有一个含有 GlyT2 mRNA。RNAscope能够以单分子分辨率对细胞和组织中的RNA分布进行可视化和分析。它支持对新型 RNA 物种、疾病机制、基因表达模式、神经元多样性和细胞相互作用的研究。
