Bu protokol, taze dondurulmuş veya sabit beyin preparatları kullanarak floresan RNAscope in situ hibridizasyon ve immünohistokimyayı birleştirir. Bu teknik, aynı doku örneğinde RNA ve protein hedeflerinin uzamsal görselleştirilmesi için oldukça hassas in situ hibridizasyon ve immünohistokimya yöntemlerinin bir kombinasyonunu göstererek esneklik sağlar. Bu yöntem, nörobilimde heterojen nöronal popülasyonlar içinde mRNA ve proteinlerin uzamsal organizasyonunun ve fonksiyonel öneminin araştırılmasına yardımcı olarak, beyin dokusu bölümünde multipleks etiketleme için geçerlidir.
Bu protokol esas olarak taze dondurulmuş doku ve paraformaldehit sabit doku için işleme adımlarına odaklanır. Taze dondurulmuş beyin dokusunu bölümlere ayırmaya başlamak için, önceden soğutulmuş kriyostat aynasına yapıştırın ve 14 mikrometre kalınlığında koronal bölümler kesin. Bölümü yüklü bir cam mikroskopi slaytına monte edin.
Monte edilmiş sürgüyü bir slayt kutusuna aktarın. Ardından kutuyu kuru buz üzerinde eksi 80 santigrat derece dondurucuya taşıyın. Doku fiksasyonu için hazırlanan paraformaldehit çözeltisini süzün.
4 santigrat dereceye kadar soğutun. Monte edilmiş sürgüyü eksi 80 santigrat derece dondurucudan kuru buz üzerine getirin ve hemen 15 dakika boyunca önceden soğutulmuş paraformaldehit çözeltisine daldırın, Cam sürgünün tamamen kuru olduğundan emin olmak için taze donmuş dokunun dehidrasyonunu gerçekleştirin. Beyni, titreşimli bir mikrotom kullanarak, transkardiyal olarak bolluk sabit bir yuvadan çıkardıktan sonra, 30 mikrometre kalınlığında doku bölümleri kesin.
Kesilen bölümleri kriyoprotektan solüsyonunda saklayın. FISH tahlili gününde, serbest yüzen bölümü 0.1 molar PBS içeren 12 oyuklu bir hücre kültürü plakasına aktarın ve kriyoprotektanı yıkamak için dönen bir platform çalkalayıcı üzerinde 90 ila 100 RPM'de çalkalayın. Ardından, bir boya fırçası kullanarak, yıkama sırasında ayrılmayı önlemek için bölümü düz bir şekilde bir cam mikroskopi sürgüsüne monte edin ve en az iki saat havayla kurutun.
Hidrofobik bir bariyer kalemi kullanarak, FISH reaktiflerini içerecek şekilde bölümün etrafına hidrofobik bir bariyer çizin. Ön işlemenin ardından doku, proteaz çözeltisi içinde inkübe edilir ve üreticinin yönergelerine göre iki saat boyunca RNAscope probları ile hibritlenir. Daha sonra ardışık amplifikasyon adımları ve floresan immünohistokimyası yapılır.
Slaytları inkübe etmek için nemlendirilmiş ışık korumalı bir oda hazırlayarak başlayın. Bir su banyosunda, 50X yıkama tamponunu ısıtın ve 10 dakika boyunca 40 santigrat dereceye kadar problayın. Oda sıcaklığına soğutulduktan sonra, 50X stok konsantrasyonundan bir litre 1X yıkama tamponu hazırlayın.
Prob karışımını metin yazısında açıklandığı gibi hazırlayın. Proteinaz tedavisi için, doku bölümüne proteinaz 3 ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Proteinazı yıkamak için, slaytı oda sıcaklığında 0.1 molar PBS'ye hafifçe daldırın ve bölümün yerinden çıkmasını önleyin.
Hibridizasyon için prob karışımını doku bölümüne ekleyin. Nemlendirilmiş önceden ısıtılmış odaya yerleştirin. Sonra 40 santigrat derecede iki saat inkübe edin.
Doku bölümünü iki dakika boyunca iki kez yıkama tamponu ile durulayın. Sinyal amplifikasyonu için, bir damlalık şişesi kullanarak, doku bölümünü kaplayacak şekilde bir amplifikasyon solüsyonu ekleyin ve metinde açıklandığı gibi inkübe edin. Bloke edici solüsyonu doku bölümüne ekleyin ve spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.
İnkübasyondan sonra fazla engelleme tamponunu çıkarmak için sürgüyü hafifçe vurun. Şimdi, bölümü gece boyunca 4 santigrat derecede birincil antikorlarla inkübe edin. Ertesi gün, slaytı 1X TBS ile üç kez yıkayın.
İkincil antikoru ekleyin ve bölümleri oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Slaytı bir kamera ile donatılmış bir epifloresan mikroskobu altında inceleyin. 20 kat büyütmede temsili görüntüler elde edin ve bunları TIF dosyaları olarak kaydedin.
Bu çalışmada, doku kalitesi, bütünlüğü ve bakteriyel kontaminasyonun yokluğu, DAPI etiketlemesinin olmaması ile doğrulanmıştır. Ubikitin C, peptidilprolil izomeraz B ve RNA polimeraz IIA mRNA'yı hedefleyen pozitif kontrol problarından etiketleme, RNA bütünlüğünü doğruladı. NTS içindeki GalR1 mRNA pozitif nöronları ayırt etmek için taze dondurulmuş preparatlarda, ek nörokimyasal belirteçler kullanıldı.
Membrana bağlı veziküler taşıyıcı açıkça etiketlendi. Buna karşılık, PHOX2B promotörü kontrolü altında eksprese edilen tirozin hidroksilaz ve GFP gibi sitoplazmik proteinler hafifçe gözlemlendi ve net bir taslaktan yoksun oldukları için topaklaştırıcı olarak tanımlandı. Sitoplazmik GalR1 mRNA'nın GalR1 FISH prob etiketlemesi noktalandı ve açıkça gözlemlendi.
İmmünohistokimya kalitesinin protein subselüler lokalizasyonuna bağlı olduğunu doğrulamak için, aynı doku kesitlerinde farklı nükleer ve sitoplazmik proteinler FISH ile paralel olarak işaretlendi. Sitoplazmik PHOX2B GFP topaklaşmış bir görünüme sahipti. Oysa nükleer PHOX2B protein sinyali açıktı, bu da FISH ile birleştirildiğinde daha yüksek kaliteli immüno-etiketlemeyi doğruladı.
FISH ile birlikte sabit donmuş kesitlerde yapıldığında, immünohistokimya subselüler lokalizasyondan bağımsız olarak güvenilirdi. GlyT2 mRNA pozitif nöronlar, NTS'nin içinde değil, NTS'nin ventralinde yer alıyordu. GlyT2 mRNA pozitif ve PHOX2B mRNA pozitif nöronlar birlikte lokalize olmadı.
PHOX2B mRNA pozitif NTS nöronlarının bir alt popülasyonu tirozin hidroksilaz immünoreaktifti ve hiçbiri GlyT2 mRNA içermiyordu. RNAscope, hücrelerde ve dokularda tek molekül çözünürlüğünde RNA dağılımının görselleştirilmesini ve analiz edilmesini sağlar. Yeni RNA türleri, hastalık mekanizmaları, gen ekspresyon modelleri, nöron çeşitliliği ve hücresel etkileşimler üzerine araştırmaları güçlendirir.
