هذا هو دليل على طريقة بسيطة للتعبير، واستخراج، وتنقية IgG الإنسان المؤتلف تنصهر إلى GFP في النباتات نيكوتيانا بنثاميانا التبغ ذات الصلة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتنقية وتصور الأجسام المضادة المنتجة في النباتات ، وانصهارات الأجسام المضادة ، ومعظم البروتينات التي يمكن تنقيتها من خلال الكروماتوغرافيا العمود. يسمح هذا البروتوكول للباحثين والطلاب في مختبرات العمل الجامعية بتصور البروتينات الموسومة GFP في معظم خطوات عملية إنتاج البروتين.
وضع الكريات الخث التربة على صينية وتصب المغلي سابقا، لا يزال الماء الساخن على الكريات الخث للتوسع الكامل. الكريات سوف يستغرق بضع دقائق لتوسيع كامل. بعد توسيع المنصات بشكل كامل، ضع اثنين إلى ثلاثة بذور Nicotiana benthamiana على كل بيليه الخث باستخدام ملاقط.
بعد ذلك، ستحتاج إلى صب حوالي 0.5 بوصة من الماء لتغطية الجزء السفلي من الدرج. لا تنسى أن تسمية علبة مع تاريخ البذر. الاستمرار في المياه الشتلات يوميا مع كميات مناسبة من الأسمدة.
يجب أن تكون مغطاة علبة مع أعلى humidome ومكان في غرفة النمو. وينبغي أن تبقى بيليه الجفت المصنف في غرفة النمو في 23 إلى 25 درجة مئوية مع فترة صورة 16 ساعة والرطوبة النسبية 60٪. بعد أسبوع واحد، وإزالة نبات إضافي من بيليه ترك كل البليت الخث مع شتلة واحدة فقط.
عندما تكون النباتات من عمر أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع ، قم بنقل كل بيليه خث إلى وعاء فردي يحتوي على رطوبة تسيطر عليها التربة. مواصلة شتلات المياه يوميا مع غرام واحد لكل لتر الأسمدة، أبدا ترك التربة جافة تماما. النباتات جاهزة للتسلل عندما يكون عمرها 5 إلى 6 أسابيع
يجب أن يتم الخطوات التالية بجانب ناسخ بونسن وينبغي تطبيق التقنيات الأساسية المطهرة لتجنب التلوث. سوف تحتاج إلى لوحة lb kanamycin. تركيز واحد من ميكروغرام لكل ملليلتر كاناميسين.
صارمة مع اثنين من الطفرات EHA105 إيواء الخاص بك المطلوب البناء مقاومة kanamycin ونمت بين عشية وضحاها. EHA105 هي واحدة من السلالات الأكثر استخداما من Agrobacterium اثنين من الطفرات. لبدء الثقافة، وملء أنبوب مخروطي مع 10 ملليلتر من وسائل الإعلام lb، المقبل، في 10 ميكرولتر من 100 ميكروغرام لكل المليلتر كاناميسين، يمكنك أيضا إضافة 10 ميكرولترات من 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من ريفامبيسين لمنع تلوث القولونية e-.
من لوحة، عليك استخدام مستعمرة معزولة واحدة التحقق من قبل PCR لتنمية ثقافتك الجديدة. اختيار مستعمرة معزولة الخاص بك وتطعيمه في رطل. وضع التطعيم على شاكر.
احتضان في 30 درجة مئوية و 120 إلى 150 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، إذا تم رسمها ثقافة البكتيريا الزراعية إلى OD600 يساوي 0.6 إلى 0.9 يمكن استخدامها للتسلل. إذا كان متضخم OD600 فوق واحد إلى مليلتر واحد ينبغي نقل إلى رطل الطازجة مع المضادات الحيوية ونمت إلى OD600 المطلوبة.
مرة واحدة في OD600 المناسبة وضع الثقافات في جهاز طرد مركزي، والتأكد من أن جهاز الطرد المركزي متوازن. بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 4، 500G لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لا يمكنهم التراكب من كلتا العينتين
ثم إعادة تعليق كل بيليه واحد X تسلل العازلة لتحقيق OD النهائي إلى 0.4. الجمع بين وحدات التخزين على قدم المساواة من كل بناء الانصهار IgG مع بناء سلسلة الضوء، للحصول على OD النهائي من 0.2 لكل بناء في كل أنبوب. خذ مشبك ورق و5 إلى 6 أسابيع من العمر ومصنع بنثاميانا من الخطوة الأولى.
باستخدام حافة حادة مشبك الورق تكشفت جعل ثقب صغير في الطبقة البشرة الأولى من ورقة. تجنب ثقب ورقة على طول الطريق من خلال. ملء حقنة ملليلتر واحد دون إبرة تعلق مع حل الزراعية البكتيريا المعدة من الخطوة الثانية.
تغطية ثقب المحرز في الخطوة السابقة مع نهاية الحقنة. وتدفع ببطء لحقن البكتيريا في ورقة بينما تطبيق ضغط العداد لطيف من وراء ورقة. محاولة التسلل إلى معظم ورقة وكزة ورقة كحد أقصى من ثلاث إلى أربع مرات، قد الضرر ورقة الزائدة تعوق إنتاج البروتين.
مشاهدة ورقة داكنة كما يتم حقن الحل دون ممارسة الكثير من الضغط على الحقنة. ورقة النبات المتسللة سوف تظهر في الغالب الظلام من وجهة النظر السفلية. لاحظ أن هذا الحل البكتيري يجب أن يكون كافياً لما لا يقل عن ثلاثة إلى أربعة نباتات لكل بناء.
اتوماتيف أي محلول بكتيري متبقي قبل التخلص منه. بعد الانتهاء من تسرب إبرة أقل، وضع النباتات مرة أخرى في غرفة النمو والاستمرار في المياه يوميا. لاحظ أوراق للكلور، نخر وكذلك لفلوريسنس GFP، مصباح الأشعة فوق البنفسجية طويلة وقصيرة الموجة في فصل الشتاء.
عادة ما يترك في الأيام أربعة وخمسة تظهر أعلى الفلورس GFP. حصاد جميع الأوراق في أربعة إلى خمسة أيام بعد التسلل ووزنها المبلغ الإجمالي لمواد ورقة. يمكنك استخدام مادة ورقة فورا لمعالجة المصب، أو يمكنك تجميده في السلبية 80 درجة مئوية حتى أنها مستعدة لاستخدام مكان النباتات تسلل مرة أخرى في غرفة النمو والاستمرار في المياه يوميا.
لاحظ أوراق للكلور، نخر، التغيرات في اللون وموت الأنسجة ورقة في المناطق المتسللة. محطات الملاحظة لفلوريسنس GFP. إذا كان GFP موجود تحت موجة طويلة وقصيرة مصباح الأشعة فوق البنفسجية.
يزيد تعبير البروتين بمرور الوقت، مع أعلى الفلورية لكل من بناءات GFP التي تحدث عادة بين أربعة أيام وخمسة أيام. حصاد جميع الأوراق في أربعة إلى خمسة أيام بعد التسلل ووزنها مجموع المواد ورقة. استخدامه على الفور لعمليات المصب أو تجميد في درجة مئوية سلبية 80 حتى جاهزة للاستخدام.
أثناء عملية المزج، تأكد من الاحتفاظ بالمخازن المؤقتة وأكواب الخلاط على الجليد أو عند أربع درجات مئوية قبل الاستخدام. ضع الأنسجة النباتية من الخطوة الرابعة إلى كوب الخلاط قبل المحاكمة. في مخزن الاستخراج المبرد الذي يحتوي على تركيزات الـ PMSSF والصوديوم على كأس الخلاط.
ضع كوب الخلاط على الخلاط، خذ ورقة ما قبل القطع من فيلم para واتمددها على الجزء العلوي من كأس الخلاط. مزيج من نسيج ورقة مع استخراج العازلة لتخيل 80 مع فواصل 22. سيكون لديك لتحريك جيدا بين دورات مزيج حسب الحاجة.
يجب أن يظهر الخليط متجانس بدون قطع من مادة الأوراق. نقل المواد المخلوطة إلى القارق. في شريط اثارة ويحرك لمدة أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لتعزيز ذوبان البروتين والسماح لهطول الأمطار من المواد الصلبة.
ضع طبقتين من القماش العاري فوق بواكر نظيف على الجليد وسكب المقتطف من خلاله لإزالة حطام الأوراق الكبيرة. بعد كل استخراج هو سكب من خلال مرآة القماش أضعاف القماش مرآة للضغط على استخراج ورقة المتبقية. يجب أن تظهر استخراج الأخضر الداكن دون الجسيمات مرئية.
نقل استخراج إلى أنابيب الطرد المركزي. الطرد المركزي استخراج في 16، 000Gs لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية. هذا سوف بيليه أي مادة غير قابلة للذوبان المتبقية.
تأكد من أن كلا الأنابيب متوازنة وأن غطاء الدوار يتم تشديده بشكل آمن. بعد الطرد المركزي، يجب أن تكون بيليه مرئية، ويقول سوبرناتور والتخلص من بيليه. تصفية المناط باستخدام حقنة 50 ملليلتر وتصفية الألياف الزجاجية.
جمع 50 ميكرولترات من عينة وتسمية استخراج الخام لتحليلها في وقت لاحق. إعداد عمود البولي بروبلين الذي يحتوي على 20 ملليلتر من العينة. تقدير كمية الطين اللازمة اعتمادا على نوع الغلوبولين المناعي المستهدف وتقاربه مع الراتنج.
في هذه المظاهرة، نستخدم ثلاثة ملليلترات من الطين. عموما ثلاثة ملليلتر من الملاط الكلي مع 1.5 ملليلتر حجم السرير هو فعال لتنقية عدة ملليغرام من الأجسام المضادة. بعناية ماصة الكمية المطلوبة من الطين resuspended في العمود توج.
افتح منفذ العمود من أسفل العمود واسمح له باستنزفه حتى يختفي معظم المخزن المؤقت. صب على الفور 10 ملليلتر من غسل العازلة مرة واحدة برنامج تلفزيوني على القمة. السماح لها استنزاف وتكرار هذه الخطوة غسل مرتين.
تطبيق نموذج تمت تصفيتها من الخطوة الخامسة إلى العمود وجمع تدفق عبر. Aliquot 50 ميكرولترات من تدفق من خلال لتحليلها في وقت لاحق. حفظ بقية تدفق من خلال في حالة عدم ربط الأجسام المضادة في الراتنج.
غسل الراتنج مرتين مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني مرة واحدة للحد من الربط غير محددة. إذا رغبت في ذلك، aliquot 50 ميكرولترات من غسل كما المصارف العازلة من خلال العمود للتحقق من أن الأجسام المضادة الهدف لا يلمح مع عازلة الغسيل. في حين أن العازلة غسل يعمل من خلال الراتنج، والإعداد وتسمية خمسة أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة مع 125 ميكرولترات من العقيمة، واحد المولى تريس-HCL في رقم H8 لتحييد عازلة elution.
بدلا من ذلك، إضافة 30 ميكرولترات من اثنين من قاعدة تريس الضرس للحصول على مزيد من eluate تتركز. خلال elution، يمكن استخدام الأشعة فوق البنفسجية للتصور. هذا لا يحتاج أن يتمّ طوال المدة من ال elution.
إذا كنت تستخدم الأشعة فوق البنفسجية، تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة لتجنب تلف العينين والجلد. لا يحتاج ضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى أن يستخدم خلال خطوة elution. Elute الأجسام المضادة عن طريق تطبيق خمسة ملليلترات من عازلة elution إلى العمود وجمع كسور ملليلتر واحد، إلى كل أنبوب المعينة من الخطوة السابقة.
تجديد العمود فورا عن طريق تطبيق 20 ملليلتر تليها 10 ملليلتر من العازلة الغسيل. ضمان لا يترك الراتنج في بيئة حمضية لفترة طويلة من الزمن. يجب أن يظهر Elution الفلورسنت.
وغالبا ما ينظر إلى أعلى fluorescence في elution الثانية، ولكن يمكن أن تختلف من استخراج إلى استخراج. للتخزين، وغسل الراتنج مع 10 ملليلتر من 20٪ الإيثانول وبرنامج تلفزيوني والسماح استنزاف في منتصف الطريق. خلاصة الجزء العلوي، ثم الجزء السفلي من العمود والحفاظ على تستقيم في أربع درجات C.Determine تركيز الأجسام المضادة باستخدام مطياف الصورة عن طريق قياس الامتصاص في 280 نانومتر.
تخزين الذرات في درجة مئوية سالبة 80 و aliquot 50 ميكرولترات من كل جزء إلى أنبوب منفصل لمزيد من التحليل. عموما يمكن إعادة استخدام فترات البروتين تصل إلى 10 مرات دون خسارة كبيرة من الكفاءة. راجع إرشادات الشركة المصنعة للحصول على تفاصيل محددة تحدد تركيز الأجسام المضادة، باستخدام مقياس الطيف الضوئي عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.
تخزين الذرات في ناقص 80 درجة مئوية و aliquot 50 ميكرولترات من كل جزء في أنبوب منفصل لمزيد من التحليل. تحليل البروتين النقي من قبل Zs الصفحة يمكن أن يتم عن طريق اتباع البروتوكولات القياسية. لوحظ الفلور نتيجة تشير إلى نجاح الاستنساخ والتسلل والتعبير عن بناء يحتوي على GFP.
على مدى بضعة أيام، ينبغي أن الفلورسنت زيادة تدريجية مع الفلورس عالية في الأيام الرابعة والخامسة. عندما يتم استخدام البروتين G بروتين الفلورسنت ملزمة و elution لاحقة من العمود يشير إلى تنقية الانصهار IgG التي تحتوي على كـ GFP مستقرة. وجل الأشعة فوق البنفسجية المكشوفة، يمكنك أن ترى فقط 25KDa و 75KDa العصابات من سلم.
يمكنك أيضا أن نرى، غير انخفاض elution 2 العينة. يحتفظ elution غير مخفضة بفلوره كما حجم النسبية التي يتوقعها من IgG سليمة كما الانصهار GFP مستقرة. في الجل وصمة عار coomassie يتم تصور كل من عينات مخفضة وغير مخفضة.
جميع مكونات سلم مرئية، ويمكن رؤية البروتينات المحلية والانصهار IgG في استخراج الإجمالي supernatant وتدفق من خلال العينات. يحتوي الغسل على كمية صغيرة من الانصهار IgG. يحتوي Elution واحد وأربعة على بروتين أقل تركيزًا كما هو متوقع لأن معظم البروتين قد استعصى بشكل عام من خطوات الـ elution الثانية والثالثة.
Elution 2 غير الحد يمكن أيضا أن ينظر إليها عدة عصابات موجودة في جميع عينات elution الحد. 75KDa يشير إلى سلسلة ثقيلة الصمامات إلى GFP. يشير 50KDa إلى سلسلة ثقيلة وحدها، يشير 25KDa إلى سلسلة ضوئية فقط، ويشير 10 KDA على الأرجح إلى التدهور الذي يمكن منعه من خلال إضافة مثبطات البروتياز.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لتنقية أي جسم مضاد منصهر لأي بروتين مستهدف مرغوب فيه. يمكن تحرير العملية لاستيعاب كميات مختلفة من مواد الأوراق ، كما يسمح بالتصميم البصري لوجود البروتين قبل وأثناء وبعد الانتهاء من عمليات استخراج البروتين وتنقيته. يمكن أن تكون هذه الأساليب مفيدة كضوابط ويمكن أن تكون غرضا لتقنيات التدريس.
