Questa è una dimostrazione di un metodo semplice per l'espressione, l'estrazione e la purificazione dell'IgG umano ricombinante fuso con GFP nelle piante di Nicotiana benthamiana legate al tabacco. Questo protocollo può essere utilizzato per la purificazione e la visualizzazione di anticorpi prodotti dalle piante, fusioni di anticorpi e la maggior parte delle proteine che possono essere purificate attraverso la cromatografia delle colonne. Questo protocollo consente ai ricercatori e agli studenti dei laboratori universitari di visualizzare le proteine taggate GFP nella maggior parte delle fasi del processo di produzione delle proteine.
Posizionare i pellet di torba del terreno su un vassoio e versare acqua precedentemente bollita e ancora calda sopra i pellet di torba per una piena espansione. I pellet richiederanno alcuni minuti per espandersi completamente. Dopo che i pallet sono stati completamente espansi, posizionare da due a tre semi di Nicotiana benthamiana su ogni pellet di torba utilizzando una pinzetta.
Dopo aver fatto questo, dovrai versare circa 0,5 pollici di acqua per coprire il fondo del vassoio. Non dimenticare di etichettare il vassoio con la data di semina. Continuare ad annaffiare le piantine ogni giorno con quantità appropriate di fertilizzante.
Il vassoio deve essere coperto con un piano umidioma e posto in una camera di crescita. Il pellet di torba seminato deve essere conservato nella camera di crescita a 23-25 gradi Celsius con un periodo fotografico di 16 ore e un'umidità relativa del 60%. Dopo una settimana, rimuovere una pianta in più dal pellet lasciando ogni pallet di torba con una sola piantina.
Quando le piante hanno dai due alle tre settimane, trasferire ogni pellet di torba in un singolo vaso contenente terreno controllato dall'umidità. Continuare ad annaffiare le piantine ogni giorno con un grammo per litro di fertilizzante, non lasciare mai il terreno completamente asciutto. Le piante sono pronte per l'infiltrazione quando hanno dalle cinque alle sei settimane.
Accanto a un bruciatore Bunsen devono essere eseguiti i seguenti passaggi e devono essere applicate tecniche asettiche di base per evitare la contaminazione. Avrai bisogno di una piastra di kanamicina Lb. Un microgrammo per concentrazione di kanamicina millilitro.
rigoroso con due mutazioni EHA105 che ospita il costrutto resistente alla kanamicina desiderato e cresciuto durante la notte. EHA105 è uno dei ceppi più comunemente usati di Agrobacterium due mutazioni. Per iniziare la coltura, riempire il tubo conico con 10 millilitri di mezzi lb, successivamente, a 10 microlitri di 100 microgrammi per millilitro kanamicina, è anche possibile aggiungere 10 microlitri di 2,5 microgrammi per millilitro di rifampicina per prevenire la contaminazione da e-coli.
Dal piatto, utilizzerai una singola colonia isolata verificata da PCR per far crescere la tua nuova cultura. Scegli la tua colonia isolata e inoculala nell'lb. Posizionare l'inoculazione sullo shaker.
incubare a 30 gradi Celsius e da 120 a 150 giri/min durante la notte. Il giorno dopo, se la coltura di Agrobacterium è attratta da OD600 pari a 0,6 a 0,9, può essere utilizzata per l'infiltrazione. Se è invaso OD600 sopra uno o due millilitri deve essere trasferito in un lb fresco con antibiotici e coltivato all'OD600 richiesto.
Una volta che l'OD600 appropriato posiziona le colture in una centrifuga, assicurandosi che la centrifuga sia bilanciata. Pelare i batteri per centrifugazione a 4.500G per 20 minuti a temperatura ambiente. Non possono sovranarsi da entrambi i campioni.
Quindi rimospendare ogni pellet e un tampone di infiltrazione X per portare l'OD finale a 0,4. Combina volumi uguali di ogni costrutto di fusione IgG con il costrutto della catena della luce, per ottenere l'OD finale di 0,2 per costrutto in ogni tubo. Prendi una graffetta e una pianta vecchia di cinque o sei settimane e benthamiana dal primo passo.
Utilizzando il bordo affilato della graffetta dispiegato si crea una piccola puntura nel primo strato epidermico della foglia. Evitare di forare la foglia fino in fondo. Riempire una siringa millilitro senza un ago attaccato con la soluzione agrobatterio preparata del secondo passo.
Coprire il foro fatto nel passaggio precedente con l'estremità della siringa. E spingere lentamente per iniettare i batteri nella foglia mentre si applica una leggera contro pressione da dietro la foglia. Cerca di infiltrarti nella maggior parte della foglia e colpire la foglia da un massimo di tre a quattro volte, il danno fogliare in eccesso può ostacolare la resa proteica.
Guarda la foglia scurirsi mentre la soluzione viene iniettata senza applicare troppa pressione sulla siringa. La foglia vegetale infiltrata apparirà per lo più scura dalla vista inferiore. Si noti che questa soluzione batterica dovrebbe essere sufficiente per almeno tre o quattro piante per costrutto.
Autoclavare qualsiasi soluzione batterica rimanente prima di scartare. Dopo aver terminato l'infiltrazione senza ago, riposizionare le piante nella camera di crescita e continuare ad annaffiare ogni giorno. Osservate le foglie per la clorosi, la necrosi e per la fluorescenza GFP, la lampada UV a onde lunghe e corte invernale.
Di solito le foglie nei giorni quattro e cinque mostrano la fluorescenza GFP più alta. Raccogliere tutte le foglie a quattro o cinque giorni dopo l'infiltrazione e pesare la quantità totale di materiale fogliare. È possibile utilizzare immediatamente il materiale fogliare per la lavorazione a valle oppure congelarlo in -80 gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'uso Posizionare le piante infiltrate nella camera di crescita e continuare ad annaffiare ogni giorno.
osservato le foglie per clorosi, necrosi, cambiamenti nel colore e morte del tessuto fogliare nelle aree infiltrate. Piante osservate per la fluorescenza GFP. Se GFP è presente sotto una lampada UV a onde lunghe e corte.
L'espressione proteica aumenta nel tempo, con la più alta fluorescenza di entrambi i costrutti GFP che generalmente si verificano tra i quattro e i cinque giorni. Raccogliere tutte le foglie a quattro o cinque giorni dopo l'infiltrazione e pesare il materiale fogliare totale. Usalo immediatamente per i processi downstream o congela a -80 gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'uso.
Durante il processo di miscelazione, assicurarsi di mantenere tamponi e tazze di frullatore sul ghiaccio o a quattro gradi Celsius prima dell'uso. Posizionare il tessuto vegetale dal quarto passaggio nella tazza del frullatore preprocesso. Al tampone di estrazione refrigerato contenente le rispettive concentrazioni di PMSF e ascorbato di sodio nella tazza del frullatore.
Posizionare la tazza del frullatore sul frullatore, prendere un foglio pretagliato di pellicola para e allungarlo sopra la parte superiore della tazza del frullatore. Frullare il tessuto fogliare con tampone di estrazione per immaginare 80 con 22 ° intervalli. Dovrai mescolare bene tra i cicli di miscelazione in base alle esigenze.
La miscela dovrebbe apparire omogenea senza pezzi di materiale fogliare. Trasferire il materiale miscelato in un becher. A una barra di agitazione e mescolarlo per quattro gradi Celsius per 30 minuti per migliorare la solubilità proteica e consentire la precipitazione dei solidi.
Posizionare due strati di stoffa nuda su un becher pulito sul ghiaccio e versare l'estratto attraverso di esso per rimuovere grandi detriti fogliari. Dopo che tutto l'estratto viene versato attraverso il panno a specchio piegare il panno specchio per spremere l'estratto di foglia residua. L'estratto dovrebbe apparire verde scuro senza particelle visibili.
Trasferire l'estratto in tubi di centrifuga. Centrifuga l'estratto a 16.000G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Ciò si attlutterà qualsiasi materiale insolubile rimanente.
Assicurarsi che entrambi i tubi siano bilanciati e che il coperchio del rotore sia saldamente serrato. Dopo la centrifugazione, il pellet dovrebbe essere visibile, dire supernatante e scartare il pellet. Filtrare il supernatante utilizzando una siringa da 50 millilitri e un filtro in fibra di vetro.
Raccogliere 50 microlitri di un campione ed etichettare l'estratto grezzo per un'analisi successiva. Impostare una colonna di polipropilene contenente 20 millilitri di campione. Stimare la quantità di liquami necessari a seconda del tipo di immunoglobulina bersaglio e della sua affinità con la resina.
In questa dimostrazione, usiamo tre millilitri di liquami. Generalmente tre millilitri di liquami totali con volume del letto di 1,5 millilitri sono efficienti per la purificazione di diversi milligrammi di anticorpi. Pipettare con cura la quantità richiesta di liquami rimorsi nella colonna limitata.
Aprire la presa di colonna dalla parte inferiore della colonna e lasciare che si scarichi fino a quando la maggior parte del buffer non è sparita. Versare immediatamente 10 millilitri di tampone di lavaggio uno per PBS sopra. Lasciare scolare e ripetere questo passaggio di lavaggio due volte.
Applicare il campione filtrato dal passaggio cinque alla colonna e raccogliere il flusso. Aliquot 50 microlitri di flow-through per analisi successive. Salvare il resto del flusso nel caso in cui l'anticorpo non si sia legato alla resina.
Lavare la resina due volte con 10 millilitri di uno per PBS per ridurre la legatura non specifica. Se lo si desidera, aliquota 50 microlitri di lavaggio mentre il tampone scorre attraverso la colonna per verificare che l'anticorpo bersaglio non sia alluso con un tampone di lavaggio. Mentre il tampone di lavaggio scorre attraverso la resina, impostare ed etichettare cinque tubi di micro centrifuga con 125 microlitri di sterile, un tris-HCL molare a pH otto per neutralizzare il tampone di eluizione.
In alternativa, aggiungere 30 microlitri di due basi tris molare per ottenere un eluito più concentrato. Durante l'eluizione, la luce UV può essere utilizzata per la visualizzazione. Ciò non deve essere fatto per tutta la durata dell'eluizione.
Se si utilizza l'UV, assicurarsi di indossare dispositivi di protezione individuale appropriati per evitare danni agli occhi e alla pelle. Non è necessario utilizzare una luce UV durante la fase di eluizione. Elute gli anticorpi applicando cinque millilitri di tampone di eluizione alla colonna e raccogliere una frazione millilitro, ad ogni tubo designato della fase precedente.
Rigenerare immediatamente la colonna applicando 20 millilitri seguiti da 10 millilitri di tampone di lavaggio. Assicurarsi che la resina non sia lasciata in un ambiente acido per un lungo periodo di tempo. L'eluizione dovrebbe apparire fluorescente.
Spesso la fluorescenza più alta si vede nella seconda eluizione, ma può variare dall'estrazione all'estrazione. Per lo stoccaggio, lavare la resina con 10 millilitri di 20%etanolo e PBS e lasciare scolare a metà strada. Riacquisendo la parte superiore, quindi la parte inferiore della colonna e mantenere in posizione verticale a quattro gradi C.Determinare la concentrazione di anticorpi utilizzando uno spettrometro fotografico misurando l'assorbanza a 280 nanometri.
Conservare gli eluati in -80 gradi Celsius e aliquota 50 microlitri di ogni frazione in un tubo separato per ulteriori analisi. Generalmente la durata delle proteine può essere riutilizzata fino a 10 volte senza una significativa perdita di efficienza. Fare riferimento alle linee guida del produttore per dettagli specifici determinare la concentrazione di anticorpi, utilizzando uno spettrofotometro misurando l'assorbanza a 280 nanometri.
Conservare gli eluati in meno 80 gradi Celsius e aliquota 50 microlitri di ogni frazione in un tubo separato per ulteriori analisi. L'analisi della proteina purificata tramite la pagina Zs può essere effettuata seguendo protocolli standard. Fluorescenza osservata come risultato che indica il successo della clonazione, infiltrazione ed espressione di un costrutto contenente GFP.
Nel corso di alcuni giorni, le fluorescenti dovrebbero aumentare progressivamente con un'alta fluorescenza nei giorni quattro e cinque. Quando si utilizza la proteina G, il legame proteico fluorescente e la successiva eluizione dalla colonna indicano la purificazione di una fusione IgG contenente come GFP stabile. E il gel esposto ai raggi UV, potete vedere solo le bande 25KDa e 75KDa della scala.
Puoi anche vedere il campione di eluizione 2 non ridotta. L'eluizione non ridotta mantiene la sua fluorescenza come dimensione relativa ci si aspetterebbe da un IgG intatto come fusione stabile della GFP. Nel gel di macchia coomassie vengono visualizzati campioni sia ridotti che non ridotti.
Tutti i componenti della scala sono visibili, le proteine native e le fusioni IgG possono essere viste nel supernatante estratto totale e fluiscono attraverso i campioni. Il lavaggio contiene una piccola quantità di fusione IgG. L'eluizione una e quattro contenevano proteine meno concentrate come ci si aspetta poiché la maggior parte delle proteine è generalmente sfuggita dalla seconda e dalla terza fase di eluizione.
Eluizione 2 non riducente può anche essere visto più bande esistono in tutti i campioni di eluizione riducente. 75KDa indica un fusibile a catena pesante per GFP. 50KDa indica una catena pesante da sola, 25KDa indica una catena leggera da sola e 10 KDA probabilmente indicano una degradazione che può essere prevenuta con l'aggiunta di inibitori della proteasi.
Questo protocollo può essere utilizzato per la purificazione di qualsiasi anticorpo fuso con qualsiasi proteina bersaglio desiderata. Il processo può essere modificato per ospitare varie quantità di materiale fogliare e consente anche la determinazione visiva della presenza proteica prima, durante e dopo la conclusione dei processi di estrazione e purificazione delle proteine. Questi metodi possono essere utili come controlli e possono essere utili per le tecniche di insegnamento.
