Esta é uma demonstração de um método simples de expressão, extração e purificação de IgG humano recombinante fundido à GFP em plantas nicotiana benthamiana relacionadas ao tabaco. Este protocolo pode ser utilizado para purificação e visualização de anticorpos produzidos por plantas, fusões de anticorpos e a maioria das proteínas que podem ser purificadas através da cromatografia da coluna. Este protocolo permite que pesquisadores e estudantes de laboratórios de trabalho universitário visualizem proteínas marcadas por GFP na maioria das etapas do processo de produção de proteínas.
Coloque as pelotas de turfa do solo em uma bandeja e despeje previamente fervida, ainda água quente sobre as pelotas de turfa para expansão total. Pelotas levarão alguns minutos para se expandir totalmente. Depois que as paletes forem totalmente expandidas, coloque de duas a três sementes nicotiana benthamiana em cada pelota de turfa usando pinças.
Depois que isso for feito, você precisará derramar cerca de 0,5 polegadas de água para cobrir o fundo da bandeja. Não se esqueça de rotular a bandeja com a data de semeadura. Continue regando as mudas diariamente com quantidades adequadas de fertilizante.
A bandeja deve ser coberta com um topo humidome e coloque em uma câmara de crescimento. A pelota de turfa semeada deve ser mantida na câmara de crescimento a 23 a 25 graus Celsius com um período de 16 horas de foto e 60% de umidade relativa. Após uma semana, remova uma planta extra da pelota deixando cada palete de turfa com apenas uma muda.
Quando as plantas têm de duas a três semanas, transfira cada pelota de turfa para um pote individual contendo solo controlado pela umidade. Continue a regar mudas diariamente com um grama por litro de fertilizante, nunca deixe o solo completamente seco. As plantas estão prontas para infiltração quando tiverem de cinco a seis semanas.
As etapas a seguir devem ser feitas ao lado de um queimador Bunsen e técnicas assépticas básicas devem ser aplicadas para evitar contaminação. Você vai precisar de uma placa de kanamicina lb. Um micrograma por concentração de kanamicina mililitro.
rigoroso com duas mutações EHA105 abrigando sua construção resistente à kanamicina desejada e cultivada durante a noite. EHA105 é uma das cepas mais utilizadas do Agrobacterium duas mutações. Para começar a cultura, preencha o tubo cônico com 10 mililitros de mídia lb, em seguida, a 10 microliters de 100 microgramas por mililitro kanamycin, você também pode adicionar 10 microliters de 2,5 microgramas por mililitro de rifampicina para evitar a contaminação por e-coli.
A partir da placa, você usará uma única colônia isolada verificada pela PCR para crescer sua nova cultura. Escolha sua colônia isolada e inocula-a na lb. Coloque a inoculação no agitador.
incubar a 30 graus Celsius e 120 a 150 RPM durante a noite. No dia seguinte, se a cultura Agrobacterium for atraída para OD600 igualando 0,6 a 0,9, ela pode ser usada para infiltração. Se for overgrown OD600 acima de um a dois mililitros deve ser transferido para um lb fresco com antibióticos e cultivado para o OD600 necessário.
Uma vez no OD600 apropriado coloque as culturas em uma centrífuga, certificando-se de que a centrífuga seja equilibrada. Pelt a bactéria por centrifugação a 4.500G por 20 minutos em temperatura ambiente. Eles não podem sobrená-los de ambas as amostras.
Em seguida, resuspenda cada pelota e um buffer de infiltração X para trazer o OD final para 0,4. Combine volumes iguais de cada construção de fusão IgG com a construção da cadeia de luz, para obter o OD final de 0,2 por construção em cada tubo. Pegue um clipe de papel e uma planta de cinco a seis semanas de idade e benthamiana a partir do primeiro passo.
Usando a borda afiada do clipe de papel desdobrada faça uma pequena punção na primeira camada epidérmica da folha. Evite perfurar a folha o tempo todo. Encha uma seringa mililitro sem uma agulha presa à solução agrobacterium preparada a partir do segundo passo.
Cubra o orifício feito na etapa anterior com o fim da seringa. E empurre lentamente para injetar as bactérias na folha enquanto aplica pressão suave contra por trás da folha. Tente se infiltrar na maior parte da folha e cutucar a folha no máximo de três a quatro vezes, danos excessivos na folha podem dificultar o rendimento da proteína.
Observe a folha escurecer à medida que a solução é injetada sem aplicar muita pressão sobre a seringa. A folha de plantas infiltrada aparecerá na maior parte escura da vista inferior. Observe que esta solução bacteriana deve ser suficiente para pelo menos três a quatro plantas por construção.
Autoclave qualquer solução bacteriana restante antes de descartar. Tendo terminado a infiltração sem agulhas, coloque as plantas de volta na câmara de crescimento e continue a regar diariamente. Observou-se as folhas para clorose, necrose, bem como para fluorescência GFP, lâmpada UV de ondas longas e curtas de inverno.
Geralmente sai nos dias quatro e cinco mostram a maior fluorescência de GFP. Colher todas as folhas em quatro a cinco dias após a infiltração e pesar a quantidade total de material da folha. Você pode usar o material da folha imediatamente para processamento a jusante, ou você pode congelá-lo em 80 graus Celsius negativo até que ele esteja pronto para usar Coloque as plantas infiltradas de volta na câmara de crescimento e continue a regar diariamente.
observaram as folhas para clorose, necrose, alterações de cor e morte de tecido de folhas em áreas infiltradas. Plantas observadas para fluorescência GFP. Se o GFP estiver presente sob uma lâmpada UV de ondas longas e curtas.
A expressão proteica aumenta ao longo do tempo, com a maior fluorescência de ambos os construtos de GFP geralmente ocorrendo entre os dias quatro e cinco. Colher todas as folhas em quatro a cinco dias após a infiltração e pesar o material total da folha. Use-o imediatamente para processos a jusante ou congele a 80 graus Celsius negativos até estar pronto para uso.
Durante o processo de mistura, certifique-se de manter tampões e copos de liquidificador no gelo ou a quatro graus Celsius antes de usar. Coloque o tecido vegetal do passo quatro no copo do liquidificador pré-julgamento. No tampão de extração refrigerado contendo suas respectivas concentrações de pmsf e ascorbate de sódio para o copo do liquidificador.
Coloque o copo do liquidificador no liquidificador, pegue uma folha pré-cortada de para filme e estique-a sobre a parte superior do copo do liquidificador. Misture o tecido da folha com o tampão de extração para imaginar 80 com 22º intervalos. Você terá que mexer bem entre os ciclos de mistura, conforme necessário.
A mistura deve parecer homogênea sem pedaços de material de folha. Transfira material misturado para um béquer. Em uma barra de mexida e mexa por quatro graus Celsius por 30 minutos para aumentar a solubilidade da proteína e permitir a precipitação de sólidos.
Coloque duas camadas de pano nu sobre um béquer limpo no gelo e despeje o extrato através dele para remover grandes detritos de folhas. Depois de todo o extrato ser derramado através do pano do espelho dobre o pano do espelho para espremer o extrato residual da folha. O extrato deve parecer verde escuro sem partículas visíveis.
Transfira o extrato para tubos de centrífuga. Centrifugar o extrato a 16.000Gs por 20 minutos a quatro graus Celsius. Isso vai pellet qualquer material insolúvel restante.
Certifique-se de que ambos os tubos estão equilibrados e que a tampa do rotor esteja bem apertada. Após a centrifugação, a pelota deve ser visível, digamos, sobrenante e descartar a pelota. Filtre o supernatante usando uma seringa de 50 mililitros e filtro de fibra de vidro.
Colete 50 microliters de uma amostra e rotule extrato bruto para análise posterior. Configure uma coluna de polipropileno que contém 20 mililitros de amostra. Estimar a quantidade de chorume necessária dependendo do tipo de imunoglobulina alvo e sua afinidade com a resina.
Nesta demonstração, usamos três mililitros de chorume. Geralmente três mililitros de chorume total com 1,5 mililitros de volume de cama é eficiente para purificação de vários miligramas de anticorpos. Pipeta cuidadosamente a quantidade necessária de chorume resuspended na coluna tampada.
Abra a saída da coluna a partir da parte inferior da coluna e deixe-a drenar até que a maior parte do buffer se vá. Despeje imediatamente 10 mililitros de tampão de lavagem uma vez PBS em cima. Deixe-o drenar e repita esta etapa de lavagem duas vezes.
Aplique a amostra filtrada da etapa cinco até a coluna e colete o fluxo.. Alíquota 50 microliters de fluxo para análise posterior. Guarde o resto do fluxo caso o anticorpo não se ligue à resina.
Lave a resina duas vezes com 10 mililitros de uma vez PBS para reduzir a ligação não específica. Se desejar, alíquota de 50 microliters de lavagem à medida que o buffer escorre pela coluna para verificar se o anticorpo alvo não está aludido com um tampão de lavagem. Enquanto o tampão de lavagem está passando pela resina, configure e rotule cinco tubos de micro centrífugas com 125 microliters de estéril, um molar tris-HCL no pH oito para neutralizar o tampão de elução.
Alternativamente, adicione 30 microliters de duas bases molar tris para obter eluato mais concentrado. Durante a eluição, a luz UV pode ser usada para visualização. Isso não precisa ser feito durante a elução.
Se você UV está sendo usado, certifique-se de usar equipamento de proteção individual adequado para evitar danos aos olhos e pele. Uma luz UV não precisa ser usada durante a etapa de eluição. Elute os anticorpos aplicando cinco mililitros de tampão de elução na coluna e coletar uma fração mililitro, para cada tubo designado da etapa anterior.
Regenere imediatamente a coluna aplicando 20 mililitros seguidos por 10 mililitros de tampão de lavagem. Certifique-se de que a resina não é deixada em um ambiente ácido por um longo período de tempo. A elução deve parecer fluorescente.
Muitas vezes a maior fluorescência é vista na segunda eluição, mas pode variar de extração para extração. Para armazenamento, lave a resina com 10 mililitros de 20% de etanol e PBS e deixe drenar no meio do caminho. Recapitule a parte superior, depois a parte inferior da coluna e mantenha-se ereto a quatro graus C.Determine a concentração de anticorpos usando um espectrômetro fotográfico medindo a absorvência em 280 nanômetros.
Armazene os eluatos em 80 graus Celsius negativos e alíquotas de 50 microliters de cada fração a um tubo separado para análise posterior. Geralmente, as durações proteicas podem ser reutilizadas até 10 vezes sem perda significativa de eficiência. Consulte as diretrizes do fabricante para obter detalhes específicos que determinem a concentração de anticorpos, usando um espectotômetro medindo a absorvância em 280 nanômetros.
Armazene os eluatos em menos 80 graus Celsius e alíquota de 50 microliters de cada fração em um tubo separado para análise posterior. A análise da proteína purificada pela página Zs pode ser feita seguindo protocolos padrão. Fluorescência observada como resultado indicando sucesso de clonagem, infiltração e expressão de uma construção contendo GFP.
Ao longo de alguns dias, as fluorescentes devem aumentar progressivamente com alta fluorescência nos dias quatro e cinco. Quando a proteína G é usada ligação de proteína fluorescente e elução subsequente da coluna indica purificação de uma fusão IgG contendo como um GFP estável. E o gel exposto UV, você pode ver apenas as bandas 25KDa e 75KDa da escada.
Você também pode ver, a amostra de elução não reduzida 2. A elução não reduzida mantém sua fluorescência como o tamanho relativo que se esperaria de um IgG intacto como sua fusão GFP estável. No gel de manchas de coomassie, amostras reduzidas e não reduzidas são visualizadas.
Todos os componentes da escada são visíveis, proteínas nativas e fusões IgG podem ser vistas no extrato total sobrenante e fluem através de amostras. A lavagem contém uma pequena quantidade de fusão IgG. A elução de um e quatro continha proteína menos concentrada, como é esperado, pois a maioria das proteínas geralmente escapou do segundo e terceiro passos de elução.
A elução 2 não redutor também pode ser vista em todas as amostras de elução redutoras. 75KDa indica um fusível de corrente pesada para GFP. 50KDa indica uma cadeia pesada sozinho, 25KDa indica uma cadeia leve sozinho, e 10 KDA provavelmente indica degradação que pode ser evitada pela adição de inibidores de protease.
Este protocolo pode ser usado para purificação de qualquer anticorpo fundido a qualquer proteína alvo desejada. O processo pode ser editado para acomodar várias quantidades de material da folha, e também permite a determinação visual da presença proteica antes, durante e após a conclusão dos processos de extração e purificação de proteínas. Esses métodos podem ser úteis como controles e podem ser propósito para técnicas de ensino.
