Este protocolo quantifica a metástase pulmonar, que é uma causa agressiva e comum de morte relacionada ao câncer de mama, com maior precisão e eficiência em um modelo pré-clínico de câncer de mama. Comparado com a técnica original, este protocolo dá aos pesquisadores resultados mais rápidos e consistentes. Alivia o erro de contagem humana através da tecnologia de computador fácil de usar.
Essa técnica pode ser absolutamente estendida a pesquisas pré-clínicas que estudam os efeitos das terapias de câncer de mama na metástase pulmonar, permitindo que os pesquisadores demonstrem uma carga metastática reduzida após o sucesso do tratamento. Comece rotulando um tubo cônico de 15 mililitros para a amostra de tecido. Em seguida, adicione 2,5 mililitros de mistura de colagem tipo quatro e 30 unidades de elastase ao tubo.
Mova o pulmão para um hbss 1X limpo bem e gire-o com fórceps para remover qualquer sangue restante, em seguida, transfira-o para uma placa de cultura de tecido vazia de 3,5 centímetros. Pique o pulmão com uma tesoura, depois enxágue a placa com 2,5 mililitros de HBSS e transfira o HBSS com os pedaços de pulmão em um tubo cônico preparado de 15 mililitros com o coquetel de colagem e elastase. Incubar o tubo por 75 minutos a quatro graus Celsius em uma roda de roqueiro ou rotativa.
Enquanto isso, rotule um tubo de centrífugas de 50 mililitros e uma placa de cultura de tecido de 10 centímetros para cada rato. Se fizer uma diluição, rotule placas suficientes de cultura tecidual para as diluições. Leve o volume do tubo até 10 mililitros com HBSS 1X e despeje o conteúdo sobre um coador de células de 70 micrômetros no tubo cônico de 50 mililitros.
Use o êmbolo de uma seringa de um mililitro para moer suavemente a amostra através do coador. Centrifugar o tubo por cinco minutos a 350 vezes G e descartar o supernascedor, em seguida, lave a pelota duas vezes com 10 mililitros de 1X HBSS. Resuspenque a pelota em 10 mililitros de 60 micromolar 6-thioguanina completa mídia cultural, e emplaque as amostras nas placas de cultura celular de 10 centímetros usando um esquema de diluição, se desejar.
Incubar as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco dias. Despeje a mídia cultural das placas no recipiente de lixo apropriado. Para fixar as células, adicione cinco mililitros de metanol não diluído em cada placa e incubar por cinco minutos em temperatura ambiente, certificando-se de girar o metanol para que cubra toda a placa.
Despeje o metanol das placas no recipiente de resíduos apropriado e enxágue cada placa com cinco mililitros de água destilada. Adicione cinco mililitros de azul de metileno de 0,03% por placa e incuba-o por cinco minutos em temperatura ambiente, certificando-se de girar a solução azul de metileno para que cubra toda a placa. Despeje o azul de metileno no recipiente de resíduos apropriado e enxágue cada prato novamente com cinco mililitros de água destilada.
Vire a placa de cabeça para baixo e borre-a contra uma toalha de papel para remover o excesso de líquido. Coloque a placa em sua tampa e deixe-a secar durante a noite. Colônias metastáticas serão azuis.
Uma vez que as placas tenham secado, elas podem ser armazenadas à temperatura ambiente indefinidamente. Remova as tampas rotuladas das placas, tomando cuidado para garantir a identificação clara das amostras. Alinhe todas as placas de pulmão manchadas em uma superfície limpa e leve.
Tire uma foto da coleção de placas em uma área bem iluminada, certificando-se de minimizar reflexões. Reflexões nas placas influenciarão a análise da imagem e devem ser evitadas. Preste muita atenção às fotografias tiradas, e tire várias fotos de vários ângulos.
Depois de fotografar as placas, corte a imagem para excluir as tampas ou qualquer coisa ao fundo. Abra a imagem em Fiji ImageJ e altere-a para preto e branco clicando em imagem, ajuste e limiar de cor. Em seguida, selecione o padrão para o método de limiar, preto e branco para a cor limiar e laboratório para espaço de cor.
Certifique-se de que a caixa de fundo escuro não está selecionada. A imagem agora deve ser em preto e branco. Preto representa o fundo leve, e branco representa as colônias metastáticas azuis.
Use a ferramenta de círculo para selecionar a área a ser analisada. Desenhe um círculo para usar em todas as placas para garantir que cada placa seja analisada para a mesma área de tamanho. Escolha um tamanho que maximize a área analisada nas placas, minimizando o ruído de fundo que aparece na borda das placas.
O tamanho aparece na barra de ferramentas à medida que é desenhado. Analise o círculo selecionado para determinar a porcentagem de área que é branca. Clique em analisar e analisar partículas, em seguida, selecione zero a infinito para tamanho, zero a um para circularidade e nada para mostrar.
Verifique a caixa resumida e bata bem. Mova o círculo para a próxima placa na imagem, agarrando-o no centro e repetindo a análise. Copie e cole o resultado em uma planilha.
A área percentual, que é o percentual da área selecionada que é branca, representa a carga metastática. Uma vez analisadas todas as placas e imagens, a média da área de porcentagem resulta entre diferentes imagens para cada placa para mitigar quaisquer inconsistências entre as imagens. A análise de Fiji ImageJ foi comparada à contagem manual e à análise histopatológica.
Quando três pesquisadores separados contaram manualmente colônias metastáticas, os resultados foram inconsistentes entre os contadores. Os resultados do Fiji ImageJ foram consistentes entre os contadores de cada uma das três imagens. Os resultados das três imagens e dos três contadores foram combinados para cada placa pulmonar.
Os resultados foram mediados para que cada placa respondesse pelas variações entre as imagens, o que proporcionou resultados consistentes entre os contadores. Ao classificar as placas da maioria para a mínima metastática, a contagem manual concordou com a placa mais confluente, mas todas as fileiras seguintes eram inconsistentes. As fileiras dos resultados médios do Fiji ImageJ foram muito mais consistentes entre os contadores.
Para demonstrar a importância de evitar reflexões nas imagens, uma imagem com o reflexo de uma mão e sua análise subsequente de Fiji ImageJ é mostrada juntamente com uma imagem da mesma placa sem um reflexo. Manchas escuras de uma superfície de fundo suja ou resíduo de amostra de sangue nas placas também podem impactar negativamente a análise de Fiji ImageJ. Esta placa sanguínea tem apenas duas colônias metastáticas, mas o resíduo escuro fez com que o Fiji ImageJ a considerasse como 31,6% metastático.
Ao tentar este protocolo, lembre-se de examinar cuidadosamente as imagens para reflexão, use o mesmo círculo de tamanho para cada placa na imagem e tenha uma média dos resultados de cada placa entre pelo menos três imagens separadas.
