Этот протокол количественно метастазы легких, который является агрессивной и распространенной причиной смерти, связанной с раком молочной железы, с повышенной точностью и эффективностью в доклинковой модели рака молочной железы. По сравнению с оригинальной техникой, этот протокол дает исследователям более быстрые и последовательные результаты. Это облегчает ошибку подсчета людей с помощью простых в использовании компьютерных технологий.
Этот метод может быть абсолютно распространен на доклинические исследования, изучающие влияние терапии рака молочной железы на метастазы легких, позволяя исследователям продемонстрировать снижение метастатического бремени после успешного лечения. Начните с маркировки 15 миллилитров конической трубки для образца ткани. Затем добавьте в трубку 2,5 миллилитров смеси коллагеназы 4 типа и 30 единиц эластазы.
Переместите легкое в чистый 1X HBSS хорошо и закружить его с типсами, чтобы удалить все оставшиеся крови, а затем передать его в пустой 3,5 сантиметра ткани культуры пластины. Измельчите легкое ножницами, затем промойте пластину 2,5 миллилитров HBSS и перенесите HBSS с кусочками легких в подготовленную 15 миллилитровую коническую трубку с коллагеназой и коктейлем эластазы. Инкубировать трубку в течение 75 минут при четырех градусах по Цельсию на рокере или вращающемся колесе.
Между тем, этикетка один 50 миллилитров центрифуги трубки и один 10 сантиметров ткани культуры пластины для каждой мыши. Если делать разбавления, этикетки достаточно пластин культуры тканей для разбавления. Доведите объем трубки до 10 миллилитров с 1X HBSS, а затем залить содержимое 70 микрометровых клеток ситечко в 50 миллилитров конической трубки.
Используйте поршень из одного миллилитрового шприца, чтобы аккуратно измельчить образец через ситечко. Центрифуга трубки в течение пяти минут при 350 раз G и отказаться от супернатанта, а затем мыть гранулы в два раза с 10 миллилитров 1X HBSS. Resuspend гранулы в 10 миллилитров 60 микромолейных 6-thioguanine полной культуры средств массовой информации, и пластины образцов в 10 сантиметров клеточной культуры пластин с использованием схемы разбавления при желании.
Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в течение пяти дней. Налейте культурные средства массовой информации от пластин в соответствующий контейнер отходов. Чтобы исправить клетки, добавьте пять миллилитров неразбавленного метанола к каждой пластине и инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре, убедившись, что закружить метанол так, что он охватывает всю тарелку.
Налейте метанол с тарелок в соответствующий контейнер для отходов, а затем промойте каждую тарелку пятью миллилитров дистиллированной воды. Добавьте пять миллилитров 0,03%метиленовый синий на тарелку и инкубировать его в течение пяти минут при комнатной температуре, убедившись, что закружить метиленовый синий раствор так, что он охватывает всю пластину. Налейте метиленовый синий в соответствующий контейнер отходов и промыть каждую тарелку снова с пятью миллилитров дистиллированной воды.
Переверни тарелку вверх дном и помарки ее против бумажного полотенца, чтобы удалить избыток жидкости. Поместите тарелку на крышку и дайте ей высохнуть на ночь. Метастатические колонии будут синими.
После того, как пластины высохли, они могут храниться при комнатной температуре бесконечно. Снимите маркированную крышку с пластин, заботясь о четкой идентификации образцов. Выстроить все окрашенные пластины легких на чистой, светлой поверхности.
Смойте коллекцию тарелок в хорошо освещенной области, убедившись, чтобы свести к минимуму отражения. Отражения в пластинах будут влиять на анализ изображения и следует избегать. Обратите пристальное внимание на фотографии, сделанные, и сделать несколько фотографий с нескольких углов.
После фотографирования пластин, обрезать изображение, чтобы исключить крышки или что-нибудь в фоновом режиме. Откройте изображение на Фиджи ImageJ и измените его на черно-белый, нажав на изображение, отрегулируйте и цвет порога. Затем выберите значение по умолчанию для метода порогового значения, черно-белый для порогового цвета и лабораторию для цветового пространства.
Убедитесь, что темная фоновая коробка не выбрана. Изображение теперь должно быть черно-белым. Черный цвет представляет световой фон, а белый представляет синие метастатические колонии.
Используйте инструмент круга, чтобы выбрать область для анализа. Нарисуйте один круг для использования для всех пластин, чтобы убедиться, что каждая пластина анализируется для той же площади размера. Выберите размер, который максимизирует анализируемую область на пластинах, минимизируя фоновый шум, который появляется на краю пластин.
Размер отображается в панели инструментов при нарисовании. Проанализируйте выбранный круг, чтобы определить процент белой области. Нажмите на анализ и анализ частиц, а затем выберите от нуля до бесконечности для размера, от нуля до одного для круговорота, и ничего для шоу.
Проверьте обобщенный ящик и ударил хорошо. Переместите круг к следующей пластине на картинке, схватив его в центр и повторите анализ. Копировать и вставлять результат в электронную таблицу.
Процентная область, которая представляет собой процент выбранной области белого цвета, представляет метастатическое бремя. После анализа всех пластин и изображений средний процент результатов между различными изображениями для каждой пластины, чтобы смягчить любые несоответствия между изображениями. Анализ Фиджи ImageJ сравнивали с ручным подсчетом и гистопатологическим анализом.
Когда три отдельных исследователя вручную подсчитали метастатические колонии, результаты были несовместимы между счетчиками. Фиджи ImageJ результаты были последовательными между счетчиками для каждого из трех изображений. Результаты трех изображений и трех счетчиков были объединены для каждой пластины легких.
Результаты были усредначены для каждой пластины для учета вариаций между изображениями, которые обеспечивали согласованные результаты между счетчиками. При ранжирование пластин от большинства до наименее метастатических, ручной подсчет согласился на наиболее слияние пластины, но все следующие ряды были несовместимы. Ряды из средних результатов Фиджи ImageJ были гораздо более последовательными между счетчиками.
Чтобы продемонстрировать важность избежания отражений в изображениях, изображение с отражением руки и ее последующим анализом Фиджи ImageJ показано вместе с изображением той же пластины без отражения. Темные пятна от грязной фоновой поверхности или остатки образца крови на пластинах также могут негативно повлиять на анализ Fiji ImageJ. Эта пластина крови имеет только две метастатические колонии, но темные остатки заставили Фиджи ImageJ считать его 31,6%метастатическим.
При попытке этого протокола, не забудьте тщательно изучить фотографии для отражения, использовать тот же круг размера для каждой пластины на изображении, и в среднем результаты для каждой пластины между по крайней мере три отдельных изображений.
