يوفر هذا البروتوكول استراتيجية بسيطة لتوليد نماذج ثقافية للخلايا من الخلايا الدهنية البيضاء والبنية التي تلخص بأمانة في المختبر ، فسيولوجيا الأنسجة الدهنية التي لدينا في الجسم الحي. يتيح هذا البروتوكول العزل المتزامن لكل من الخلايا التمهيدية البيضاء والبنية من الفئران حديثي الولادة والخلايا التي نعزلها باستخدام هذه الطريقة لتقييم القدرة التكاثرية العالية وإمكانات التمايز. تعكس الخلايا المعزولة باستخدام هذا النهج تعقيد الأنسجة الدهنية بشكل أفضل من نماذج الثقافة الأخرى.
ويمكن استخدامه لدراسة وظيفة الخلايا الدهنية بشكل أكثر دقة في السمنة والسكري. نحن نركز في المقام الأول على فهم خلل الأنسجة الدهنية في السمنة. ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام الخلايا المعدة بهذه الطريقة لدراسة الأسئلة الأساسية حول الخلية في علم الأحياء التنموي.
مفتاح تجربة ناجحة هو تحديد كيفية تحديد المستودعات الدهنية البيضاء مثل هذه المستودعات ، والتي هي صغيرة ، ولكنها غنية جدا وتكاثر preadipocytes يمكن أن يكون من الصعب التمييز في الجراء. توضح العرض البصري مدى بساطة هذا البروتوكول وتسمح بتوفير نصائح لتحديد وتشريح المستودعات الدهنية البيضاء والبنية. رؤية عزلة المستودع مفيدة للغاية.
لجمع الأنسجة الدهنية البيضاء تحت الجلد، وقطع الجلد حول البطن من الجرو حديثي الولادة القتل الرحيم، وسحب الجلد بلطف تحت الساقين. دون جمع أي أنسجة الجلد، وحصاد بعناية مستودع الدهون، والتي سوف تظهر على شكل واضح أو أبيض، رقيقة ممدود الأنسجة تعلق على داخل الجلد أو على رأس quadriceps. شطف مستودع حصادها في برنامج تلفزيوني ووضع الأنسجة الدهنية في أنبوب 1.5 ملليلتر تحتوي على 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني و 200 ميكرولتر من العازلة العزل 2X على الجليد.
لجمع الأنسجة الدهنية البنية بين الكتفين، اسحب الجلد من شفرات الكتف فوق الرأس وارفع الأنسجة الدهنية البنية الحمراء العميقة الموجودة بين شفرات الكتف. إجراء شقوق بعناية في جميع أنحاء الدهنية لفصله عن الجسم والتحقق من الأنسجة للاتساق واللون. بعد الشطف، ضع الأنسجة في أنبوب ثاني 1.5 ملليلتر يحتوي على 250 ميكرولتر من PBS و 200 ميكرولتر من العازلة العزلة 2X على الجليد.
عندما يتم جمع جميع المستودعات، استخدم مقص لفرم بلطف كل مستودع أربع إلى ست مرات مباشرة داخل الأنابيب وإضافة 50 ميكرولتر من الكولاجينز 10X في العازلة العزلة 2X إلى كل أنبوب. ثم عكس الأنابيب بسرعة لخلط ووضع الأنسجة في خلاط درجة الحرارة التي تسيطر عليها لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية و 1400 الثورات في الدقيقة الواحدة. في نهاية عملية الهضم، ضع الأنابيب مرة أخرى على الجليد وتصفية الأنسجة الهضمية من خلال 100 مصفاة خلية ميكرون في أنابيب جديدة 50 ملليلتر.
لتحقيق أقصى قدر من إنتاجية الخلية، شطف كل أنبوب مع ملليلتر واحد من العزلة المتوسطة وتصفية هذا الغسيل من خلال مصفاة. تمييع حلول الأنسجة الدهنية البني والأبيض إلى ملليلترين من تعليق الأنسجة لكل بئر لكل مستودع في وسط عزل جديد. ثم لوحة اثنين من ملليلتر من تعليق الأنسجة الدهنية البيضاء إلى كل من أربعة إلى ستة آبار واثنين من ملليلتر من تعليق الأنسجة الدهنية البني إلى كل بئر من اثنين إلى ثلاثة آبار من لوحة بئر ستة من خلال مرشح واحد 100 ميكرون لكل بئر.
عندما تكون جميع الخلايا مطلية، ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 60 إلى 90 دقيقة. في نهاية الحضانة، اغسل كل بئر بميليلترين من المتوسط الخالي من المصل وحرض الطبق برفق لفصل أي خلايا دم من قاع الآبار. بعد ثلاث يغسل، إضافة اثنين من ملليلتر من العزلة المتوسطة الطازجة إلى الآبار والعودة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية.
عندما تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ التقاء، معطف لوحات الوجهة الجديدة مع عقيمة 0.1٪ الجيلاتين في الماء المقطر في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. في حين أن لوحات هي حضانة, غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني قبل العلاج مع تريبسين لمدة ثلاث دقائق في حاضنة ثقافة الخلية. عندما تكون الخلايا قد انفصلت، ماصة تعليق الخلية عدة مرات لتحقيق أقصى قدر من استعادة الخلية ونقل الخلايا إلى أنبوب جديد.
عندما يتم جمع جميع الخلايا، اغسل كل بئر بميليلتر واحد من وسيط العزل واسحب الغسيل مع تعليق الخلية. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة إنفاق بيليه في ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من العزلة المتوسطة للعد. تمييع الخلايا إلى التركيز المناسب للطلاء في عزلة جديدة المتوسطة وغسل لوحات الجيلاتين المغلفة مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي الجيلاتين الزائدة.
ثم بذر الخلايا على لوحات الجيلاتين المغلفة والعودة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية. عندما تصل الخلايا إلى التقاء، استبدال وسيط العزلة مع وسيطة التمايز. إذا كان التمييز بين الخلايا الدهنية البنية preadipocytes، إضافة أيضا واحدة ثلاثية الكائنات النانوية triiodothyronine.
بعد 48 ساعة، قم بتحديث الوسط مع الحجم المناسب من الصيانة المتوسطة لكل ثقافة. في هذا الوقت ، يجب أن يصبح تراكم قطرات السائل الصغيرة داخل الخلايا مرئيا تحت المجهر الميداني الساطع. حتى بعد التصفية، تبقى بعض الحطام الخلوي وخلايا الدم داخل تعليق الخلية.
يغسل لطيف بعد ساعة واحدة من الطلاء سوف إزالة الخلايا غير ذات الصلة كما تعلق preadipocytes بسرعة إلى الجزء السفلي من البئر. على الرغم من أن كل من الخلايا التمهيدية البيضاء والبنية المعزولة عن الجراء حديثي الولادة لديها قدرة انتشار عالية ، فإن غلة الخلايا التمهيدية البيضاء عادة ضعف ما هي عليه في الخلايا المسبقة البنية على أساس كل مستودع. لذلك ، إذا رغبت الثقافات المتزامنة ، يجب حساب كثافة البدء هذه من preadipocytes البيضاء وفقا لذلك.
في نهاية التمايز ، ستظهر الخلايا محملة بقطرات الدهون وستعبر عن علامات كلاسيكية من الخلايا الدهنية البيضاء والبنية ، على التوالي. في هذا التحليل المقارن لاستهلاك الأكسجين في اختبار الإجهاد الميتوكوندريا للخلايا الدهنية البيضاء والبنية الأولية في ظل ظروف القاعدية ، وكذلك استجابة للمحفزات المعروفة لوظيفة الميتوكوندريا ، يمكن ملاحظة هذه القدرات الحيوية المحددة من كل نوع من أنواع الخلايا. تذكر أننا نعزل الخلايا الحية وأننا نريد استزراعها لعدة أيام.
لذا تأكد من الحفاظ على ظروف معقمة أثناء العزل لتجنب التلوث ، مما قد يعرض الثقافة اللاحقة للخطر. هذه الطريقة يولد adipocytes ناضجة تماما التي يمكن استخدامها لتطبيقات مختلفة، بما في ذلك المقايسات الوظيفية، والشاشات الوراثية أو الكيميائية، أو التنميط omics لدراسة آليات مستقلة الخلية التي تؤثر على وظيفة adipocyte.
