이 프로토콜은 우리가 생체 외에서 가지고있는 지방 조직의 생리학인 체외에서 충실하게 재구성하는 백색과 갈색 지방 세포의 세포 문화 모델을 생성하기위한 간단한 전략을 제공합니다. 이 프로토콜은 신생아 마우스와 우리가 이 방법을 사용하여 격리하는 세포에서 백색과 갈색 지방세포의 동시 분리를 가능하게 하고 높은 증식 능력 및 분화 잠재력을 평가합니다. 이 접근법을 사용하여 분리된 세포는 다른 배양 모델보다 지방 조직의 복잡성을 더 잘 반영한다.
그리고 비만과 당뇨병에서 지방 세포 기능을 보다 정확하게 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 비만에 있는 지방 조직 기능 장애를 이해하는 데 주로 집중합니다. 그러나, 이 방법으로 준비된 세포는 또한 발달 생물학에 있는 세포에 관하여 기본적인 질문을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.
성공적인 실험의 핵심은 작은, 그러나 매우 풍부하고 확산 preadipocytes 새끼에서 구별하기 어려울 수 있습니다 이러한 창고로 흰색 지방 창고를 식별하는 방법을 결정하는 것입니다. 시각적 데모는 이 프로토콜이 얼마나 간단한지 보여 주며 흰색 및 갈색 지방 창고를 찾고 해부하기 위한 팁을 제공 할 수 있습니다. 창고 격리를 보는 것은 매우 도움이됩니다.
피하 백색 지방 조직을 수집하려면 안락사 된 신생아 새끼의 복부 주위에 피부를 자르고 다리 아래 피부를 부드럽게 당깁니다. 피부 조직을 수집하지 않고, 조심스럽게 피부 내부 또는 사두근의 상단에 부착 된 투명 하거나 흰색, 얇은 길쭉한 조직으로 나타납니다 지방 창고를 수확. PBS에서 수확된 창고를 헹구고 250마이크로리터의 PBS와 얼음에 2X 절연 버퍼200마이크로리터를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브에 지방 조직을 배치합니다.
중간 갈색 지방 조직을 수집하려면 어깨 블레이드에서 머리를 위로 끌어 와 견갑골 사이에있는 깊은 붉은 갈색 지방 조직을 들어 올립니다. 조심스럽게 몸에서 분리하고 일관성과 색상을 위해 조직을 확인하기 위해 지방 주위의 절개를합니다. 헹구고, PBS 250 마이크로리터와 얼음에 2X 절연 버퍼의 200 마이크로리터를 포함하는 두 번째 1.5 밀리리터 튜브에 조직을 배치합니다.
모든 창고를 채취하면 가위를 사용하여 각 창고를 튜브 내부에 4~6회 부드럽게 다진 다음 각 튜브에 2배 격리 버퍼에 10X 콜라게나아제 50마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 빠르게 반전하여 조직을 온도 조절 믹서에 30분 동안 섭씨 37도, 분당 1400개의 회전으로 놓습니다. 소화가 끝나면 튜브를 얼음에 다시 넣고 100 미크론 세포 스트레이너를 통해 소화 조직을 새로운 50 밀리리터 튜브로 필터링합니다.
세포 수율을 최대화하기 위해 각 튜브를 절연 매체 1밀리리터로 헹구고 스트레이너를 통해 세척을 필터링합니다. 갈색과 흰색 지방 조직 솔루션을 신선한 절연 매체에서 창고 당 잘 조직 현탁액 의 2 밀리리터에 희석. 그런 다음 백색 지방 조직 현탁액의 2 밀리리터를 각각 4-6 개의 우물과 갈색 지방 조직 현탁액 2 개씩 잘 당 100 미크론 필터를 통해 6 개의 우물 6 개 중 2 ~ 3 개의 우물에 접시를 접시.
모든 세포가 도금되었을 때, 60~90분 동안 세포 배양 배양배인 배양에 플레이트를 놓는다. 인큐베이션의 끝에서, 세럼이없는 매체의 두 밀리리터로 각각 잘 씻고 부드럽게 우물의 바닥에서 혈액 세포를 분리하기 위해 접시를 교반. 세 번의 세차 후, 우물에 신선한 절연 매체의 2 밀리리터를 추가하고 세포 배양 인큐베이터에 접시를 반환합니다.
세포가 80~90%의 합류에 도달하면, 10분 동안 섭씨 37도에서 증류수에 멸균 0.1%젤라틴으로 새로운 대상 플레이트를 코팅합니다. 플레이트가 배양하는 동안, 세포 배양 인큐베이터에서 트립신으로 치료하기 전에 PBS로 세포를 씻으십시오. 세포가 분리되면 세포 현탁액을 여러 번 피펫하여 세포 회복을 극대화하고 세포를 새로운 튜브로 이송합니다.
모든 세포가 수집되면, 격리 배지의 1 밀리리터로 각각 잘 씻고 세포 현탁액으로 세척을 당깁니다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 계산을 위한 격리 매체의 3~5밀리리터에서 펠릿을 재보중단한다. 신선한 절연 매체에서 도금에 적합한 농도로 세포를 희석하고 여분의 젤라틴을 제거하기 위해 PBS로 젤라틴 코팅 플레이트를 세척합니다.
그런 다음 세포를 젤라틴 코팅 플레이트에 시드하고 세포를 세포 배양 배양기인으로 되돌려 줍니다. 세포가 합류성에 도달하면 격리 배지를 분화 매체로 바꿉시다. 갈색 지방 조직 지방 세포를 분화하는 경우, 또한 하나의 나노 몰트리오도티로닌을 추가합니다.
48시간 후, 배양당 적절한 유지 보수 매체로 매체를 새로 고칩니다. 이때, 세포 내의 작은 액체 물방울의 축적은 밝은 필드 현미경 검사의 밑에 보일 되어야 합니다. 여과 후에도 일부 세포 이물질과 혈액 세포는 세포 현탁액 내에 남아 있습니다.
부드러운 도금 후 1 시간 동안 세차하여 지방 세포가 우물 바닥에 빠르게 부착됨에 따라 관련이없는 세포를 제거합니다. 신생아 새끼로부터 분리된 백색과 갈색 프레드포스세포는 모두 높은 증식 능력을 가지고 있지만, 백색 지방세포의 수율은 일반적으로 창고 당 갈색 프레드포사이클의 두 배입니다. 따라서 동기화된 배양을 원하는 경우 백색 프레드포스세포의 시작 밀도를 그에 따라 계산해야 합니다.
분화의 끝에서, 세포는 지질 물방울로 로드되는 것처럼 보이고 각각 백색과 갈색 지방세포의 고전적인 마커를 발현할 것이다. 기저 조건 하에서 1차 백색 및 갈색 지방세포의 미토콘드리아 스트레스 테스트에서 산소 소비를 비교분석할 뿐만 아니라 미토콘드리아 기능의 알려진 자극기에 대한 반응뿐만 아니라, 각 세포 유형의 이러한 특정 생체 에너지 능력을 관찰할 수 있다. 우리는 살아있는 세포를 고립시키고 있으며 며칠 동안 세포를 배양하고 싶다는 것을 기억하십시오.
따라서 오염을 피하기 위해 격리 중에 멸균 상태를 유지하여 후속 배양을 손상시킬 수 있습니다. 이 방법은 기능성 분석을 포함하여 다른 응용 프로그램에 사용할 수있는 완전히 성숙한 안도세포를 생성, 유전 또는 화학 스크린, 또는 omics 프로파일링은 세포 자율 적 메커니즘을 연구하는 것은 안도 세포 기능에 영향을 미치는.
