نحن نقر بمرفق تحليل الخلايا المجهرية من Mayo Clinic (مايو كلينك) لتحليل التدفق الخلوي الأساسي للحصول على المساعدة في فرز FACS.

تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية للحيوان بموافقة لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في Mayo Clinic (مايو كلينك).
1. إعداد الحل 
<ol><li>إعداد الكولاجين 2٪ (ث / الخامس) حل عن طريق حل الكولاجين الثاني 2 ز في 100 مل هانكس 'محلول الملح المتوازن (HBSS). Aliquot 200 ميكرولتر لكل استخدام.</li>
	<li>إعداد وسيط تحييد عن طريق خلط 84 مل F-12 المتوسطة، 15 مل مصل الخيل، و 1 مل البنسلين / ستربتوميسين.</li>
	<li>إعداد تدفق العازلة التميتري عن طريق حل 500 ملغ من الألبومين مصل الأبقار (BSA) و 400 ميكرولتر من 0.5 M EDTA في 100 مل من محلول ملحي Dulbecco الفوسفات المخزنة (DPBS).</li>
</ol>2. تشريح من وسادة الدهون epididymal وتفكك الأنسجة
<ol><li>القتل الرحيم إنسانيا (isoflurane / خلع عنق الرحم) فأر ذكر واحد. في هذا البروتوكول، تم استخدام ماوس FVB عمرها أربعة أشهر.</li>
	<li>تطبيق / رش 70٪ الإيثانول على البطن وفضح تجويف البطن السفلي باستخدام مقص نظيفة والملقط.</li>
	<li>تحديد موقع لوحة الدهون الظهارية (قريب / تعلق على الخصيات). عقد تقاطع بين الخصيات ومنصة الدهون epididymal مع ملقط حادة وسحب بلطف لتحرير وسادة الدهون epididymal.</li>
	<li>إزالة الخصيات عن طريق قطع باستخدام مقص واحتضان وسادة الدهون epididymal في 5 مل من HBSS تكملها 3٪ BSA في أنبوب مخروطي 50 مل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي عند 150 × ز لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>اتخاذ عائمة رقة الدهون الظهارية من أنبوب مخروطي 50 مل و mince ناعما الأنسجة باستخدام مقص نظيفة.</li>
	<li>أضف محلول 200 ميكرولتر كولاجيناز 2٪ إلى 3.8 مل من HBSS في أنبوب ثقافة 13 مل. إضافة الأنسجة المفروم واحتضان في حاضنة الدورية في 5 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية. بدلا من حاضنة الدورية، حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية يمكن استخدامها بدلا من ذلك مع الانفعالات في بعض الأحيان.</li>
	<li>نقل محتويات كاملة إلى أنبوب مخروطي 50 مل وإضافة 10 مل من وسيط تحييد. تخلط بلطف عن طريق عكس الأنبوب 2-3 مرات.</li>
	<li>إعداد أنبوب مخروطي آخر 50 مل مزودة مصفاة خلية 70 ميكرومتر. تصفية الأنسجة المهضوبة في أنبوب جديد باستخدام مصفاة الخلية.</li>
	<li>نقل تدفق من خلال أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي في 350 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.</li>
	<li>إزالة بعناية الكريات الخلية فائقة وsuspend مع 5 مل من DPBS. جهاز طرد مركزي عند 350 x ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>إزالة بعناية فائقة وإضافة 50 ميكرولتر من تدفق العازلة cytometry. تخلط جيدا عن طريق الأنابيب بلطف والحفاظ على الخلايا على الجليد. نظرا لحجم الكريات الخلية وكمية صغيرة من فائقة المتبقية، فإن الحجم الكلي للخلايا في المخزن المؤقت للخلايا تدفق يكون أكبر من 50 ميكرولتر (حوالي 100 ميكرولتر).</li>
</ol>3. وضع علامات الأجسام المضادة وفرز الخلايا المفلورة المنشطة (FACS)
<ol><li>بعد خلط الخلايا جيدا مع الأنابيب لطيف، نقل 54 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب microcentrifuge 1.7 مل. إضافة 6 ميكرولتر من FcR حظر الكاشف ويخلط جيدا عن طريق الأنابيب بلطف. احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. حفظ أي بقايا الخلايا بعد أخذ 54 μL والاحتفاظ بها في الجليد لاستخدامها كتحكم غير ملوث في الخطوة 3.5 والخطوة 3.6.</li>
	<li>أثناء الحضانة في الخطوة 3.1، وإعداد كوكتيل الأجسام المضادة من خلال الجمع بين 11 ميكرولتر كل من المضادة-Sca1-APC، المضادة ل-Ter119-FITC، المضادة لـ CD31-FITC، ومضادات CD45-FITC الأجسام المضادة في أنبوب microcentrifuge. تخلط جيدا عن طريق الأنابيب لطيف والحفاظ على الجليد المحمية من الضوء.</li>
	<li>بعد الحضانة مع FcR منع الكاشف لمدة 10 دقيقة، إضافة 40 μL من كوكتيل الأجسام المضادة وخلط جيدا عن طريق الأنابيب لطيف. احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>إضافة 500 μL من تدفق العازلة قياس الخلايا تكملة مع 1 ميكروغرام / مل من DAPI في الخلايا الملطخة. مزيج جيد عن طريق الأنابيب لطيف وخلايا التصفية باستخدام أنبوب اختبار 5 مل مع غطاء المفاجئة مصفاة الخلية. إبقاء الخلايا على الجليد.</li>
	<li>أضف 500 ميكرولتر من مخزن قياس الخلايا المتدفق إلى الخلايا المتبقية في الخطوة 3.1 واخلط جيداً عن طريق الأنابيب اللطيفة. خلايا التصفية باستخدام أنبوب اختبار 5 مل مع غطاء المفاجئة مصفاة الخلية. الاحتفاظ بهذه الخلايا على الجليد واستخدامها كتحكم غير ملوث في الخطوة التالية.</li>
	<li>خذ الخلايا الملطخة والسيطرة غير الملطخة إلى تحليل FACS أو أداة الفرز.<ol>
<li>تحديد وعزل APC+/FITC-/DAPI- السكان مع استراتيجيات الغاتة الموضحة في الشكل 1. وتمثل هذه الخلايا Sca1 قابلة للحياة+/ Ter119-/CD31-/ CD45- الخلايا. تستنفد مجاميع الحطام والخلية باستخدام مخططات التشتت الأمامي والجانبي .(SSC). ثم، DAPI- يتم بوابات السكان، تليها الغاءات من APC+/ FITC- السكان. يجب استخدام عناصر التحكم غير المُطَرَّكة للمساعدة في تعيين معلمات البوابات.</li>
		<li>جمع الخلايا في 500 ميكرولتر من تدفق العازلة للخلايا في أنبوب microcentuge 1.5 مل. للمضي قدما، ينبغي أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة للحد من التلوث. يتم جمع ما يقرب من 50،000 - 100،000 خلية من فأرة واحدة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت لتقييم جدوى الخلية. وبما أن مجاميع الخلايا يمكن أن تتداخل مع تحليلات المصب، فإن وجود مجاميع الخلايا يتم تقييمه أيضاً لضمان وجود الحد الأدنى (<5٪ من عدد الخلايا القابلة للتطبيق) لهذه المجاميع.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution.">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li><li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+obesity+in+man:+cellular+character+of+the+adipose+tissue.">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li><li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity.">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li><li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue.">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li><li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+as+a+Disease.">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li><li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment:+going+back+to+the+future.">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li><li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling.">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).</li><li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling.">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li><li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice.">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636 (2018).</li><li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue.">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501 (2019).</li><li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots.">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li><li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues.">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li><li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells.">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li><li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples.">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219 (2020).</li><li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice.">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057 (2018).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair.">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li><li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects.">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li></ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

تسلسل RNA خلية واحدة (scRNA-seq) تكتسب بسرعة الجر كأداة قوية لدراسة في وقت واحد مجموعات الخلايا المتنوعة على مستوى الخلية الواحدة. نظراً لارتفاع التكاليف المرتبطة بإعداد العينة وتسلسل الإنتاجية العالية، لا بد من تحسين المدخلات الخلوية (قابلية البقاء العالية والنقاء) لزيادة احتمال النجاح التجر...

يلعب النسيج الدهني دورًا رئيسيًا في استقلاب الطاقة. يتم تخزين الطاقة الزائدة في شكل الدهون، والأنسجة الدهنية قادرة على التوسع أو التراجع كبيرة اعتمادا على الوضع الغذائي والطلب النشط. يمكن أن ينتج توسع الأنسجة الدهنية عن زيادة حجم الخلايا الشحمية (تضخم) و/أو من زيادة في عدد الخلايا الدهنية (فرط التنسج)؛ العملية الأخيرة ينظمها بإحكام انتشار وتمايز الخلايا السلف الدهنية1,2. خلال السمنة، الأنسجة الدهنية يتوسع بشكل مفرط، والخلل الوظيفي الأنسجة – بما في ذلك نقص الأكسجة, التهاب, ومقاومة الأنسولين – غالبا ما يتطور3,4. هذه المضاعفات هي عوامل الخطر للعديد من الأمراض المزمنة بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم والسكري وأمراض القلب والأوعية الدموية والسكتة الدماغية والسرطان5. وبالتالي، الحد من توسع الأنسجة الدهنية غير المنضبط وتخفيف أمراض الأنسجة الدهنية هي أعلى أولويات البحوث الطبية الحيوية. خلال توسع الأنسجة الدهنية ، يتكاثر الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية المقيمة (ASCs) ويميز بشكل متسلسل إلى preadipocytes (الخلايا السلف الملتزمة) ثم إلى الخلايا الدهنية الناضجة6. تظهر الدراسات الحديثة أحادية الخلية RNA تسلسل (scRNA-seq) أن هذه الخلايا السلف الدهنية (APC) السكان (ASCs وpreadipocytes) تظهر التجانس الجزيئي والوظيفية كبيرة7,8,9,10,11,12. على سبيل المثال، تعرض ASCs قدرة تمايز adipogenic مخفضة، في حين تظهر أيضًا قدرات أعلى للانتشار والتوسع، مقارنة بـ preadipocytes7. يتم الإبلاغ عن مزيد من الاختلافات الجزيئية داخل ASC والسكان preadipocyte، على الرغم من أن الأهمية الوظيفية لهذه الاختلافات لا تزال غير واضحة7. وتبرز هذه البيانات مجتمعة تعقيد تجمع الخلايا السلف الدهنية وتؤكد على الحاجة إلى تطوير وتوحيد الأدوات لتحسين فهم ومعالجة هذه التجمعات السكانية الحرجة من الخلايا.
هذا البروتوكول تفاصيل عزل Sca1 قابلية عاليةللحياة + مجموعات الخلايا السلف الدهنية من الماوس منصات الدهون الظهارية التي هي مناسبة لتحليلات المتلقين للحساسية، بما في ذلك دراسات الخلية المفردة (scRNA التسلسل) وثقافة الخلية. تم إجراء عزل وتفكك منصات الدهون الظهارية كما سبق وصفها7,13 مع تعديلات طفيفة تحسن من صلاحية الـ APCs المعزولة. باختصار، تلطخ الخلايا المنفصلة من منصات الدهون الظهارية بالأجسام المضادة ضد Sca1، وهي علامة لكل من ASCs وpreadipocytes6و7وعلامات النسب الأخرى (Lin): Ter119 (الخلايا الإريثرويدية)، CD31 (الخلايا البطانية)، وD45 (الكريات البيض). سكا 1 قابلة للحياة+/ Ter119-/ CD31-/ CD45-/ DAPI- ثم يتم فرز الخلايا من قبل فرز الخلايا المنشطة الفلورة (FACS). الأهم من ذلك، تم التحقق من صحة هذا البروتوكول من خلال عزل ناجحة وتحليل Sca1+/Lin- الخلايا السلف الدهنية ذكرت في دراسة حديثة تسلسل RNA خلية واحدة التي حددت الاكتظاظ الفرعي غير متجانسة وظيفيا داخل ASCs و preadipocytes7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="799">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">87003-294</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">13 mL culture tube</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-809-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">15 mL conical tube</td>
			<td style="width:181px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5 mL test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:181px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">70 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-CD31-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-CD45-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-Sca1-APC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-Ter119-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-112-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">BSA</td>
			<td style="width:181px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DAPI</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">F-12 medium</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">FcR blocking reagent</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hanks&#39; balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Horse serum</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues

السمنة والاضطرابات الأيضية مثل مرض السكري, أمراض القلب, والسرطان, وترتبط جميع مع إعادة عرض الأنسجة الدهنية مثيرة. الخلايا الدهنية الدهنية (APCs) الأنسجة المقيمة تلعب دورا رئيسيا في الأنسجة الدهنية التوازن ويمكن أن تسهم في علم الأمراض الأنسجة. إن الاستخدام المتزايد لتكنولوجيات تحليل الخلايا المفردة - بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية وبروتيوميكس أحادي الخلية - يحول مجال الخلايا الجذعية/السلفة من خلال السماح بحل غير مسبوق لتغيرات التعبير الخلوي الفردية في سياق التغيرات السكانية أو على نطاق الأنسجة. في هذه المقالة، ونحن نقدم بروتوكولات مفصلة لتشريح الماوس الأنسجة الدهنية الظهارية، وعزل الخلايا الدهنية واحدة مشتقة من الأنسجة، وتنفيذ الفلوريسنس تنشيط فرز الخلايا (FACS) لإثراء لSCA1+/ CD31 قابلة للحياة-/ CD45-/ Ter119- APCs. وستتيح هذه البروتوكولات للمحققين إعداد مراكز عالية الجودة من الكارود للأفراد مناسبة للتحليلات النهائية مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

تم استخدام فئران FVB الذكور البالغ من العمر أربعة أشهر في هذه التجربة. وبعد استبعاد الحطام والمزدوجة باستخدام مخططات FSC/SSC، تم اًبواؤها ببوابات الخلايا القابلة للحياة (DAPI- السكان)، يليها اختيار APC+/ FITC- السكان (الشكل 1). تم رسم بوابات DAPI و APC و FITC استنادًا إلى ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues at JoVE.com

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

نحن نقدم طريقة بسيطة لعزل الخلايا الدهنية الصالحة للحياة للغاية من منصات الدهون الظهارية الماوس باستخدام فرز الخلايا المنشطة الفلوريس.

إعداد الخلايا الدهنية بروجينيتور من ماوس Epididymal الأنسجة الدهنية

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

preparation-adipose-progenitor-cells-from-mouse-epididymal-adipose

Research

JoVE Journal

Biology

5.5K Views.  Mayo Clinic. نحن نقدم طريقة بسيطة لعزل الخلايا الدهنية الصالحة للحياة للغاية من منصات الدهون الظهارية الماوس باستخدام فرز الخلايا المنشطة الفلوريس.

Video: Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult stem cells from liposuctioned adipose tissue that they initially termed Processed Lipoaspirate Cells or PLA cells. Since then, these stem cells have been renamed as Adipose-derived Stem Cells or ASCs and have gone on to become one of the most popular adult stem cells populations in the fields of stem cell research and regenerative medicine. Thousands of articles now describe the use of ASCs in a variety of regenerative animal models, including bone regeneration, peripheral nerve repair and cardiovascular engineering. Recent articles have begun to describe the myriad of uses for ASCs in the clinic. The protocol shown in this article outlines the basic procedure for manually and enzymatically isolating ASCs from large amounts of lipoaspirates obtained from cosmetic procedures. This protocol can easily be scaled up or down to accommodate the volume of lipoaspirate and can be adapted to isolate ASCs from fat tissue obtained through abdominoplasties and other similar procedures.

In 2001, researchers at UCLA described the isolation of a population of adult stem cells, termed Adipose-derived Stem Cells or ASCs, from adipose tissue. This article outlines the isolation of ASCs from lipoaspirates using a manual, enzymatic digestion protocol using collagenase.

عزل الخلايا الجذعية من دليل الدهنية المشتقة من Lipoaspirates الإنسان

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. Adipogenic differentiation of progenitor cells is a major mechanism driving adipose tissue expansion and dysfunction in response to obesity. Understanding changes to perivascular adipose tissue (PVAT) is thus clinically relevant in metabolic disease. However, previous studies have been predominately performed in the mouse and other animal models. This protocol uses human thoracic PVAT samples collected from patients undergoing coronary artery bypass graft surgery. Adipose tissue from the ascending aorta was collected and used for explantation of the stromal vascular fraction. We previously confirmed the presence of adipose progenitor cells in human PVAT with the capacity to differentiate into lipid-containing adipocytes. In this study, we further analyzed the differentiation potential of cells from the stromal vascular fraction, presumably containing multi-potent progenitor cells. We compared PVAT-derived cells to human bone marrow MSC for differentiation into adipogenic, osteogenic, and chondrogenic lineages. Following 14 days of differentiation, specific stains were utilized to detect lipid accumulation in adipocytes (Oil red O), calcific deposits in osteogenic cells (Alizarin Red), or glycosaminoglycans and collagen in chondrogenic cells (Masson&#8217;s Trichrome). While bone marrow MSC efficiently differentiated into all three lineages, PVAT-derived cells had adipogenic and chondrogenic potential, but lacked robust osteogenic potential.

The goal of this protocol is to test the ability of progenitor cells derived from human perivascular adipose tissue to differentiate into multiple cell lineages. Differentiation was compared to mesenchymal stem cells derived from human bone marrow, which is known to differentiate into adipocyte, osteocyte, and chondrocyte lineages.

قدرة التمايز للخلايا الدهنية ارتشاح الابهري البشرية السلف

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, uncoupling of metabolism to generate heat, and secretion of adipokines to regulate whole-body homeostasis and immune responses. Emerging research is identifying important regional differences in the developmental, molecular, and functional profiles of adipocytes located in discrete depots throughout the body. Different properties of the depots are medically relevant since metabolic diseases often demonstrate depot-specific effects. This protocol will provide investigators with a detailed anatomic atlas and dissection guide for the reproducible and accurate identification and excision of diverse mouse adipose tissues. Standardized dissection of discrete adipose depots will allow detailed comparisons of their molecular and metabolic characteristics and contributions to local and systemic pathologic states under various nutritional and environmental conditions.

Adipocytes exist in discrete depots and have diverse roles within their unique microenvironments. As regional differences in adipocyte character and function are uncovered, standardized identification and isolation of depots is crucial for advancement of the field. Herein, we present a detailed protocol for the excision of various mouse adipose depots.

تحديد وتشريح مستودعات الماوس المتنوعة

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

تقييم استجابه نغمه الاوعيه الدموية باستخدام الشرايين المساريقيه المعزولة مع التركيز علي التحوير بواسطة الانسجه الدهنية الوعائية

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) provide a consistent ex vivo cellular system that are functionally like that of in vivo adipocytes. Use of ADSCs in biomedical research allows for cellular investigation of adipose tissue metabolic regulation and function. ADSC differentiation is necessary for adequate adipocyte expansion, and suboptimal differentiation is a major mechanism of adipose dysfunction. Understanding changes in ADSC differentiation is crucial to understanding the development of metabolic dysfunction and disease. The protocols described in this manuscript, when followed, will yield mature adipocytes that can be used for several in vitro functional tests to assess ADSC metabolic function, including but not limited to assays measuring glucose uptake, lipolysis, lipogenesis, and secretion. Rhesus macaques (Macaca mulatta) are physiologically, anatomically, and evolutionarily similar to humans and as such, their tissues and cells have been used extensively in biomedical research and for development of treatments. Here, we describe ADSC isolation using fresh subcutaneous and omental adipose tissue obtained from 4&#8211;9-year old rhesus macaques. Adipose tissue samples are enzymatically digested in collagenase followed by filtration and centrifugation to isolate ADSCs from the stromal vascular fraction. Isolated ADSCs are proliferated in stromal media followed by approximately 14&#8211;21 days of differentiation using a cocktail of 0.5 &#956;g/mL dexamethasone, 0.5 mM isobutyl methylxanthine, and 50 &#956;M indomethacin in stromal media. Mature adipocytes are observed at approximately 14 days of differentiation. In this manuscript, we describe protocols for ADSC isolation, proliferation, and differentiation in vitro. Although, we have focused on ADSCs from rhesus macaque adipose tissue, these protocols can be utilized for adipose tissue obtained from other animals with minimal adjustments.

In this article, we describe isolation of rhesus macaque derived adipose-derived stem cells (ADSCs) using an enzymatic tissue digestion protocol. Next, we describe ADSC proliferation which includes cell detachment, counting and plating. Lastly, ADSC differentiation is described using specific adipogenic inducing agents. Additionally, we describe staining techniques to confirm differentiation.

عزل وتكاثر وتمايز الخلايا الجذعية المشتقة من المكاك الريسوس الدهنية

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...

Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone regulation, barrier functions, and angiogenesis. Endothelial cell dysfunction is a hallmark predictor and major driver for the progression of severe cardiovascular diseases, yet the underlying mechanisms remain poorly understood. The ability to isolate and perform analyses on endothelial cells from various vascular beds in their native form will give insight into the processes of cardiovascular disease. This protocol presents the procedure for the dissection of mouse subcutaneous and mesenteric adipose tissues, followed by isolation of their respective arterial vasculature. The isolated arteries are then digested using a specific cocktail of digestive enzymes focused on liberating functionally viable endothelial cells. The digested tissue is assessed by flow cytometry analysis using CD31+/CD45&#8722; cells as markers for positive endothelial cell identification. Cells can be sorted for immediate downstream functional assays or used to generate primary cell lines. The technique of isolating and digesting arteries from different vascular beds will provide options for researchers to evaluate freshly isolated vascular cells&#160;from arteries of interest and allow them to perform a wide range of functional tests on specific cell types.

This protocol details a method for the dissection of mouse adipose depots and the isolation and digestion of respective arteries to liberate and then identify the endothelial cell population. Freshly isolated cells used in downstream applications will advance the understanding of vascular cell biology and the mechanisms of vascular dysfunction.

عزل وتحديد الخلايا البطانية الوعائية من المستودعات الدهنية المتميزة للتطبيقات النهائية

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية وتوصيفها

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in addition to their great capacity for self-renewal, migration, and proliferation. Adipose tissue is one of the least invasive and most accessible sources of mesenchymal cells. It has also been reported to have higher yields compared to other sources, as well as superior immunomodulatory properties. Recently, different procedures for obtaining adult mesenchymal cells from different tissue sources and animal species have been published. After evaluating the criteria of some authors, we standardized a methodology that is applicable to different purposes and easily reproducible. A pool of stromal vascular fraction (SVF) from perirenal and epididymal adipose tissue allowed us to develop primary cultures with optimal morphology and functionality. The cells were observed adhered to the plastic surface for 24 h, and exhibited a fibroblast-like morphology, with prolongations and a tendency to form colonies. Flow cytometry (FC) and immunofluorescence (IF) techniques were used to assess the expression of the membrane markers CD105, CD9, CD63, CD31, and CD34. The ability of adipose-derived stem cells (ASCs) to differentiate into the adipogenic lineage was also assessed using a cocktail of factors (4 &#181;M insulin, 0.5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine, and 1 &#181;M dexamethasone). After 48 h, a gradual loss of fibroblastoid morphology was observed, and at 12 days, the presence of lipid droplets positive to oil red staining was confirmed. In summary, a procedure is proposed to obtain optimal and functional ASC cultures for application in regenerative medicine.

تسليط الضوء على المؤلف: عزل وتحديد الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية لفئران Sprague Dawley  

This protocol describes a methodology for isolating and identifying adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) from Sprague Dawley rats.

عزل وتحديد الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية لفئران Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

زراعة الخلايا preadipocytes المعزولة من الأنسجة الدهنية حول الأوعية الدموية الفئران

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown adipocytes. Recent discoveries have shed light on the central role of PVAT in regulating vascular homeostasis and participating in the pathogenesis of cardiovascular diseases. A comprehensive understanding of PVAT properties and regulation is of great importance for the development of future therapies. Primary cultures of periaortic adipocytes are valuable for studying PVAT function and the crosstalk between periaortic adipocytes and vascular cells. This paper presents an economical and feasible protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, which can be useful for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro. The protocol outlines tissue processing and cell differentiation for culturing periaortic adipocytes from young mice. This protocol will provide the technological cornerstone at the bench side for the investigation of PVAT function.

تسليط الضوء على المؤلف: أهمية العزلة والثقافة والحث الأديبوجيني للخلايا preadipocytes المشتقة من SVF من الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية للفأر 

Here, we describe the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, allowing for the study of perivascular adipose tissue function and its relationship with vascular cells.